lördag 15 december 2018

Dolikolisykli endoplasmisessa retikulumissa . Flippaasin merkitys

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29236390

Abstract

To verify the idea that extracellular free oligosaccharides might be able to reflect the functional status of the endoplasmic reticulum (ER) and lysosomal-endosomal system, HPLC-profiles of serum-derived free oligosaccharides (FOS) in human healthy aging, acute myeloproliferative neoplasms, and cardiovascular pathologies were compared with intracellular glycans.
After plasma deproteinization and FOS purification the oligosaccharides were labelled with anthranilic acid, separated into the neutral and charged with QAE Sephadex (Q25-120) chromatography and analysed using high-performance liquid chromatography (HPLC).
The charged FOS were digested with a sialidase and compared with free oligosaccharides from transferrin for structural decoding. HPLC-profiles of serum-derived FOS revealed mild delay of the dolichol phosphate cycle in ER, moderate intensification of ER-associated degradation (ERAD) and degradation in endosomal-lysosomal system with aging; an inhibition of the dolichol phosphate cycle, intensification of ERAD and increasing of lysosomal exocytosis in acute myeloproliferative neoplasms; intensification of ERAD and glycocojugate degradation with endosomal-lysosomal system in cardiovascular diseases. As serum free oligosaccharides are able to reflect specifically perturbations in ER and endosomal-lysosomal system under wide range of stressors they can serve as extracellular markers of functionality of these organelles.

PMID:: 29236390
DOI:: 10.15407/ubj89.01.059

[Indexed for MEDLINE]

FLIPPAASIN merkitys

Dolikolin merkityksestä: Polyprenolien ryhmää

Dolicholsynthesis:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4281381/
The schematic presentation of the biosynthetic pathway leading to the synthesis of Dol-P is shown in Fig. 1. Dolichol in animals and yeast is considered as the end-product of the mevalonate (MVA) pathway. In summary, condensation of three acetyl-CoA molecules gives rise to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA which by HMG-CoA reductase (HMGR), the enzyme considered as the regulatory point of the entire MVA pathway, is converted into mevalonate. Combined activity of three subsequent enzymes leads to synthesis of isopentyl diphospate (IPP), the building block for isoprenoids. Further condensation of three IPP molecules results in formation of farnesyl diphosphate (FPP), which is considered as a critical branch-point of the pathway. It serves as substrate for four different pathways:

squalene synthase that catalyzes the first step leading to production of cholesterol,
trans-prenyltransferase involved in ubiquinone side-chain synthesis,
protein farnesyltransferase responsible for posttranslational farnesylation of proteins and
cis-prenyltransferase, the first specific enzyme in dolichol biosynthesis pathway.

https://www.researchgate.net/publication/12196198_Suppression_of_dolichol_synthesis_with_isoprenoids_and_statins_may_potentiate_the_cancer-retardant_efficacy_of_IGF-I_down-regulation

Article in Medical Hypotheses 56(1):12-6 · February 2001 with 12 Reads

DOI: 10.1054/mehy.2000.1073 · Source: PubMed

2001 Jan;56(1):12-6.

Suppression of dolichol synthesis with isoprenoids and statins may potentiate the cancer-retardant efficacy of IGF-I down-regulation.

McCarty MF¹. Abstract

Agents that inhibit the synthesis of mevalonate or of downstream isoprenoids block the G1-S transition and induce apoptosis in many cell lines; these agents include statins, phenylacetate, and a range of cyclic and acyclic isoprenoids. This cytostatic effect is mediated primarily by decreased availability of dolichol; this deficit impedes the glycosylation of nascent IGF-I receptors, preventing their transfer to the cell surface. In most tissues as well as transformed cell lines, IGF-I activity is crucial for transition to S phase, and also prevents apoptosis.
Thus, down-regulation of serum levels of free IGF-I - as may be achieved by caloric restriction, low-fat vegan diets, and various estrogen agonists/antagonists - may represent a useful strategy for preventing and controlling cancer; however, a compensatory up-regulation of tissue expression of IGF-I receptors limits the efficacy of such an approach.
Concurrent use of agents that inhibit dolichol synthesis can be expected to prevent an increase in plasma membrane IGF-I receptors, thus potentiating the cancer-retardant efficacy of IGF-I down-regulation. Since dolichol and IGF-I appear to be essential for angiogenesis, these measures may also prove useful for control of pathogenic neovascularization.

PMID:
DOI:: 10.1054/mehy.2000.1073

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29297247

2018 Jun;82(6):947-955. doi: 10.1080/09168451.2017.1411775. Epub 2018 Jan 3.

The history and recent advances in research of polyprenol and its derivatives.Sagami H¹, Swiezewska E², Shidoji Y³. Abstract

The reduction pathway leading to the formation of dolichol was clarified in 2010 with the identification of SRD5A3, which is the polyprenol reductase. The finding inspired us to reanalyze the length of the major chain of polyprenol and dolichol from several plant leaves, including mangrove plants, as well as from animal and fish livers by 2D-TLC. Polyprenol- and dolichol-derived metabolites such as polyprenylacetone and epoxydolichol were found together with rubber-like prenol. This review focuses on analyses of polyprenol and its derivatives, including recently found epoxypolyprenol and polyprenylacetone. Attention has also been paid to the chromatographic behavior of rubber-like prenol on TLC. KEYWORDS: Prenol; acetone; dolichol; epoxide; rubberPMID:

DOI:: 10.1080/09168451.2017.1411775

[Indexed for MEDLINE]

REDUKTAASI löytö 2010

SRD5A3
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/79644

Also known as: CDG1P; CDG1Q; KRIZI; SRD5A2L; SRD5A2L1
Summary: The protein encoded by this gene belongs to the steroid 5-alpha reductase family, and polyprenol reductase subfamily. It is involved in the production of androgen 5-alpha-dihydrotestosterone (DHT) from testosterone, and maintenance of the androgen-androgen receptor activation pathway. This protein is also necessary for the conversion of polyprenol into dolichol, which is required for the synthesis of dolichol-linked monosaccharides and the oligosaccharide precursor used for N-linked glycosylation of proteins. Mutations in this gene are associated with congenital disorder of glycosylation type Iq. [provided by RefSeq, Mar 2011]
Expression: Ubiquitous expression in gall bladder (RPKM 7.7), endometrium (RPKM 4.5) and 25 other tissues See more
Orthologs mouse all

Preferred Names: polyprenol reductase

Names

3-oxo-5-alpha-steroid 4-dehydrogenase 3

S5AR 3

SR type 3

probable polyprenol reductase

GeneRIFs: Gene References Into FunctionsWhat's a GeneRIF?

Proteiinin geranylgeranylaation merkityksestä luonnollisessa immuniteetissä( Akula Murali 2018)

Eilisen väitöskirjan (Akula Murali) ruotsalainen yhteenveto löytyi väitöskirjan sivuilta ja teen siitä suomennosta: http://hdl.handle.net/2077/57427

”Geranylgeranylaasientsyymi (GGT-1) kytkee noin sataan solun sisällä olevaan proteiiniin isoprenoidin, rasvamolekyylin, joka täten prenyloi proteiinin.

Eräs prenyloituvien proteiinien luokka on RHO-proteiinit. RHO-proteiinit ovat infektioissa ja vaurioissa aktivoituvien tulehdussolujen funktiolle tärkeitä. On oltu kauan sitä mieltä, että RHO-proteiinit pystyvät kiinnittymään prenyloituina helpommin solukalvoon, jossa ne pääsevät kontaktiin RHO-proteiinien aktivaattoriproteiinien kanssa. Kun ensi kertaa alettiin tätä tutkia, havaittiin odotetusti hiiren makrofagien GGT-1 -poistogeenisyyden estävän RHO-proteiinien modifioitumisen , mutta odottamatonta löytöä oli, että inaktivoitumisen sijasta RHO-proteiinit koostuivat kokoon aktiivissa muodossaan ja makrofageista tuli hyperaktiivisia ja ne aiheuttivat tulehdusta ja nivelreumaa.

Tutkijoita kiinnosti myös, miten statiinit pystyvät aktivoimaan RHO-proteiineja ja stimuloimaan esiin tulehduksellisten ainesten tuotantoa. Kun statiinit estävät kolesterolin syntetisoitumista, estyy myös kyseessä olevien RHO-proteiinien prenylaatioon tarvittavien prenyloivien lipidimolekyylien (isoprenoidien) tuotanto. Tämä väitöstyö keskittyy tutkimaan näitä ongelmia.

Ensimmäisessä osatyössä tutkijaryhmä havaitsi, että GGT-1-puutteisissa makrofageissa aktivoitui pyriini-inflammasomi (MEFV) ja kaspaasi-1, mitkä johtivat inflammaatiota käynnistävien ainesten kuten IL-1b tuotantoon. Toisessa osatyössä tutkijat havaitsivat, että hiirillä RAC1 yksinään vastasi tulehduksen ja reumatismin kehkeytymisestä. Lisäksi tutkijat havaitsivat, että jos RAC1 jää prenyloitumatta, se muuttuu hyperaktiiviseksi, sillä se saa vahvasti lisääntyneen kyvyn sitoutua RAS-GTPaasia aktivoivan proteiinin(GAP) kaltaiseen proteiiniin 1 (IQGAP1) ja TIAM 1 (GEF).

TIAM1 ja IQGAP1- proteiinit antavat stimulaatiota NF-kB-proteiinille, inflammasomille ja kaspaasi-1:lle.

Osoitettaessa RAC1:n ja IQGAP1:n osallistumiset tehtiin ensin RAC1- poistogeenisyys ja havaittiin reumatismin käytännöllisesti katsoen kadonneen. Kun sitten tehtiin IQGAP1-poistogeenisyys, havaittiin RAC1-proteiinin ja muiden RHO-proteiinien saaneen takaisin normaaliaktiivisuutensa sekä tulehduksen ja reumatismin parantuneen.

Tutkijat huomasivat myös, että statiinit estävät RAC1-proteiinin prenyloitumista ja lisäävät IL-1b-tuotantoa ja tämä vaikutus riippuu IQGAP1:stä

Näistä tutkimuksista voidaan tehdä johtopäätös, että prenylaation estyttyä RAC1 sitoutuu IQGAP1- ja TIAM1- proteiineihin, muuttuu hyperaktiiviksi ja aiheuttaa massiivin tulehduksen. Tämä puolestaan merkitsee sitä, että prenyloituminen normaalisti toimiessaan jarruttaa immuunivastetta estämällä RAC1-proteiinin aktivoitumista.

Laajemmin asiaa katsoen nämä tulokset jo sinänsä johtavat prenylaation lisääntyneeseen ymmärtämiseen , mutta lisäksi tunnistettiin IQGAP1 ja jossain määrin myös RAC1 uusina mahdollisina lääkekohteina, joita voidaan käyttää epätavallisen ja vakavan autoinflammtorisen taudin, mevalonikinaasin puutteen, hoitoon.

Sitat" Sammanfattning

Enzymet geranylgeranyltransferase typ I (GGTase-1) kopplar på en fettmolekyl på ett 100-tal proteiner inne i celler i en process som kallas prenylering.
En klass proteiner som prenyleras heter RHO-proteiner. RHO-proteiner är viktiga för funktionen hos inflammatoriska celler som aktiveras vid infektioner och skador. Man har länge tänkt att prenyleringen gör att RHO-proteinerna lättare kan binda till membran i cellen där de kommer i kontakt med proteiner som aktiverar RHO-proteinerna. När vi först studerade detta fann vi att om man knockar ut genen som kodar för GGTase-1 i makrofager hos möss så hindras modifieringen av RHO-proteiner, som förväntat, men istället för att inaktiveras så ansamlade sig RHO-proteinerna i sin aktiva form, och makrofagerna blev hyperaktiva och orsakade inflammation och ledgångsreumatism.

Vi är också intresserade av hur de kolesterolsänkande statinerna kan aktivera RHO-proteiner och stimulera produktion av inflammatoriska substanser. När statinerna hämmar kolesterolsyntesen så hämmas också produktionen av den fettmolekyl (isoprenoid) som kopplas på RHO-proteinerna. I denna avhandling har jag försökt svara på dessa frågor.

I det första projektet, fann vi att i makrofager som saknar GGTase-1 aktiverar pyrin-inflammasomen och caspas-1 som leder till produktionen av en inflammationsdrivande susbtans som heter interleukin 1-beta (IL-1b).
I det andra projektet fann vi att RHO-proteinet RAC1 ensamt ansvarar för utvecklingen av inflammation och reumatism i mössen.
Vi fann vidare att när RAC1 inte prenyleras, så blir det hyperaktivt på grund av att det får en kraftigt ökad förmåga att binda till proteinerna TIAM1 och IQGAP1 vilka stimulerar signalering till proteinerna NF-KB och som tidigare, till inflammasomen och caspas-1.

För att bevisa inblandingen av RAC1 och IQGAP1 så knockade vi först ut genen för RAC1 och fann att inflammationen och reumatismen så gott som försvann, och när vi knockade ut genen för IQGAP1 fann vi att RAC1 (och övriga RHO-proteiner) återfick normalaktivitet och att inflammationen och reumatismen botades.
Vi fann också att att statiner hämmar prenylering av RAC1 och ökar produktionen av IL-1b och att denna effekt beror på IQGAP1.

Från dessa studier kan vi dra slutsatsen att när prenylering hämmas, så binder RAC1 till IQGAP1 och TIAM1, blir hyperaktivt och orsakar sen massiv inflammation.
Detta betyder i sin tur att prenylering normalt sett fungerar som en broms för immunförsvaret genom att hämma RAC1-aktivering.

I ett bredare perspektiv leder våra resultat till en ökad förståelse för prenylering i sig, men vi identifierar också IQGAP1, och till viss mån även RAC1, som nya potentiella måltavlor för läkemedel som kan användas för behandling av en ovanlig men allvarlig autoinflammatorisk sjukdom som heter Mevalone kinase deficiency (MKD) ."

GGTase-1, Geranylgeranyltransferase type 1

RAC1, Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1

RHO, Ras homolog gene family

IQGAP1, Ras GTPase-activating-like protein IQGAP1 (GAP- lik)

TIAM1, T-cell lymphoma invasion and metastasis- inducing protein 1 ( GEF)

MKD, Mevalonate kinase deficiency

Muistiin 15.12. 2018

etsin näistä kahdesta geenistä lähdetietoa

IQGAP1 gene (15q26.1) encodes GAP like protein. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8826

TIAM1 gene (21q22.11), encodes GEF , (Guanine nucleotide exchange factor)

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7074

TIAM1 gene

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7074
This gene encodes a RAC1-specific guanine nucleotide exchange factor (GEF). GEFs mediate the exchange of guanosine diphosphate (GDP) for guanosine triphosphate (GTP). The binding of GTP induces a conformational change in RAC1 that allows downstream effectors to bind and transduce a signal. This gene thus regulates RAC1 signaling pathways that affect cell shape, migration, adhesion, growth, survival, and polarity, as well as influencing actin cytoskeletal formation, endocytosis, and membrane trafficking. This gene thus plays an important role in cell invasion, metastasis, and carcinogenesis. In addition to RAC1, the encoded protein activates additional Rho-like GTPases such as CDC42, RAC2, RAC3 and RHOA. This gene encodes multiple protein isoforms that experience a diverse array of intramolecular, protein-protein, and phosphorylation interactions as well as phosphoinositide binding. Both the longer and shorter isoforms have C-terminal Dbl homology (DH) and pleckstrin homology (PH) domains while only the longer isoforms of this gene have the N-terminal myristoylation site and the downstream N-terminal PH domain, ras-binding domain (RBD), and PSD-95/DlgA/ZO-1 (PDZ) domain. [provided by RefSeq, Jul 2017]

summary
smart00325 Location:77 → 266: RhoGEF; (GEF) Guanine nucleotide exchange factor for Rho/Rac/Cdc42-like GTPases
cd01255 Location:268 → 439: PH2_Tiam1_2; T-lymphoma invasion and metastasis 1 and 2 Pleckstrin Homology (PH) domain, C-terminal domain

Esimerkkejä netistä Ras-superperheen merkityksestä syövän säätelyssä . Geranylgeranylaatiosta esimerkki

https://www.researchgate.net/figure/Signaling-pathways-downstream-of-Ras-a-farnesylated-small-GTPase-Ras-directly-activates_fig1_51704480

Signaling pathways downstream of Ras, a farnesylated small GTPase. Ras directly activates the mitogen activated protein kinase (MAPK) cascade, through phosphorylation of Raf (or other MAPK kinase kinase, MAPKKK) which in turn phosphorylates MEK (or other MAPK kinases), which then phosphorylates MAPK. On the other hand, Ras also activates Rac GTPases, which in turn activates p21-activated kinase (PAK), an Akt interacting protein. Rac also can activate Rho GTPases, which regulates actin stress fiber and focal adhesion formation by activating Rho kinase, which in turn regulates the activity of myosin light chain which controls actin polymerization.

Context 1

... by Rho kinase, a serine-threonine kinase that induces the formation of actin stress fibers and focal adhesions by phosphorylating myosin light chain (MLC), which promotes actin-binding to myosin II [ 78]. The Rho-kinase inhibitor, Y- 27632, inhibited chemotactic migration in vitro and metastatic growth of PC3 cells in immune- compromised mice, reduced MLC phosphorylation and markedly altered cell morphology [79], indicating that invasiveness of human prostate cancer is facilitated by the Rho/Rho-kinase pathway. RhoC GTPase is also expressed and activated in PC-3 cells, whereas RhoC inhibition promotes IGF-I stimulated random motility but decreases in vitro invasion and metastases, and results in drastic morphologic changes and alterations in the expression and distribution of focal adhesion-related proteins [80]. Studies indicated that RhoC was required for directed migration and invasion, whereas Rac1 was required for tumor cells to degrade the basement membrane, allowing them to escape the blood vessel (diapedesis) [81]. RhoC was increased in highly metastatic sublines of LNCaP cells, compared to the parental line, whereas treatment with a small hairpin RNA (shRNA) specific for RhoC suppressed collagen-mediated invasion [82]. Significantly, RhoC activation was selectively blocked with antibodies to α 2 β 1 indicating that RhoC was activated downstream of integrin activation. In contrast, RhoC had no effect on cell proliferation in vitro or on tumor growth in mice [83]. Immunohistochemical analyses on tumor specimens from 63 PCa patients showed that RhoC expression had no significant correlation with Gleason grade, but had significant positive correlation with both lymph node and distant metastasis, and was inversely correlated with patient survival [83]. Ras overexpression has also been associated with increased metastasis. Early studies showed that H-ras overexpression increased the metastatic ability of AT2 cells [84], although the incidence of Ras mutations in PCa patients are rare [85]. Oncogenic Ras promoted metastasis to multiple organs, including bone and brain – however, detailed analysis indicated that activa- tion of the Raf/ERK pathway downstream of Ras stimulated metastasis to the brain, while activation of the RalGEF pathway led to bone metastases, but did not affect subcutaneous tumor growth [86]. Ras has multiple effectors – including Rac and Rho and can signal to various pathways, including proliferation (through ERK/ MAPK) and motility, and is one of the most com- mon oncogenes displaying aberrant activation in human cancers (Figure 5). It can also interact with the PI3K/Akt pathway, either by PI3K inter- action or through Rac1, which in turn activates p21-activated kinase (PAK), an Akt interacting protein (Figure 5). However, since Ras activation through mutagenesis is rare in human PCa, these proteins are likely to play a more impor- tant role in metastasis. Taken together, these studies indicate an important role for isoprenylated small GTPases in advanced PCa rather than in early stage PCa. Multiple in vitro studies have demonstrated that statins inhibit isoprenylation of small GTPases in PCa cell lines. Most of these studies utilized lovastatin, the first statin to come on the market in 1987 [87], although mevastatin had been the first statin drug to be produced [88]. In vitro studies utilized lovastatin at 50 μM, which completely inhibited the production of GGPP and FPP in PCa cells [89]. Lovastatin was shown to inhibit PCa cell growth, alone or in combination with other drugs [90]. In 1999, we first demonstrated that PCa cell growth was regulated by geranylgeranylation and not by farnesylation [16]. When treated with lovastatin, PCa cell lines derived from transgenic mice with adenocarcinoma of the prostate (TRAMP) showed inactivation of the small GTPase RhoA. The geranylgeranylated Rho family, including RhoA, Rac1, and Cdc42Hs, are involved in cell shape regulation and actin filament assembly. Inacti- vating these proteins with lovastatin caused cell rounding and actin filament disassembly. Our results showed that activation of Rho proteins was necessary for cell proliferation [16]. Exogenous addition of geranylgeraniol (GGOL), but not farnesol (FOL), rescued TRAMP cells from the anti-proliferative effects of lovastatin and also translocated RhoA from the cytosol to the membrane where RhoA was active. Active RhoA was also found to be necessary for TRAMP cell prolif- eration. Our results were upheld by a 2008 study by Hoque et al., showing that lovastatin and simvastatin decreased cell survival in three PCa cell lines (PC3, DU145, and LNCaP) by inducing apoptosis and cell growth arrest at G1 phase and by suppressing RhoA activation [17]. This study also showed that HMG-CoA induced ...

View

Context 2

... by Rho kinase, a serine-threonine kinase tha

Isopreenirakenteista yleistä

Prenylaatio tai isoprenylaatio tarkoittaa hiiliketjun muuttamista solusynteeseissä siten, että lidipikaltaisuus lisääntyy, "lipidoitumista". Tällainen hiiliketju saa ankkuriominaisuuksia
ja peptidi, joka prenyloituu saa hankittua ankkurin itselleen, ja pystyy sijottumaan solukalvoon.
Ihmisen kehossa suorittaa prenylaatiota sellainen aineenvaihduntareitti kuin MEVALONIHAPPOTIE:Tämä tie tunnetaan lähinnä siitä, että sen lopusta syntyy myös KOLESTEROLI ja DOLIKOLI.
KOLESTEROLI ja DOLIKOLI ovat vastavaikuttajia ja
vastaavat solukalvojen fluiditeetista sen vedenpitävyyden lisäksi.
Mutta DOLIKOLI-fosfaatti on myös tärkeä, koska
sen varaan asettuu glykoproteiinien sokerirakenteita solukalvoon ( Glykocalyx).
Monta isoprenoidia ( joita keho ei pysty tekemään) saadaan ravinnossa, kuten rasvaliukoisia vitamiineja.(AEK)

PRENYLAATIOISTA

LÄHDE: Michal Gerhard . Editor. Biochemical Pathways. An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology.

ISOPREENI

Tällä kertaa kirjoitan sellaisesta asiasta kuin prenylaatiosta tai oikeastaan isoprenylaatiosta.

Kehossa on sellaisia essentiellejä hiiliketjuyksikköjä, joissa on 5 hiiltä tietystä erityisessä rakenteessa. (ISOPREENI). Mutta kehon oma järjestelmä ei ole ihmiselle aivan niin riittävä kuin kasveille ja bakteereille, sillä ihminen tarvitsee osan ”prenyloituja” molekyylejä essentielleinä vitamiineina (A,E,K) ravinnon taholta. Myös valmista kolesteroliakin tarvitaan hieman ravinnossa, vaikka endogeeninenkin kolesterolitie toimii ja se tulee tästä prenylaatiotiestä skvaleenin kautta.

Prenylaatio tai isoprenylaatio tai ”lipidaatio” muuntaa hiiliketjua siten, että siihen liitetään hydrofobisia ryhmiä, jolloin saadaan kalvoliukoisuutta. Tämä ominaisuuson hyvä ankkuritoiminnoissa proteiineille, jotka sen takia mielellään antavat ”prenyloida” rakenteensa.

(Prenylation or isoprenylation or lipidation is the addition of hydrophobic molecules to eg. a protein)..

HMG-CoA merkitys. Mevalonaattitie tuottaa prenyloitumista

Ihmisen fundamentaalisimmasta aineenvaihdunnasta käsin voi syntetisoitua sellaista molekyyliä kuin mevalonihappo (MEVALONATE). Tämä aineenvaihdunnallinen tie tunnetaankin mevalonihappotienä. Sen tunnetuin päätuote on kolesteroli ( Cholesterol) ja koska kolesterolin aineenvaihdunnassa on nykymaailman aikaan paljon epätasapainoa, on ratkaisuna ollut kolesterolin alentaminen puuttumalla mevalonihappotiehen aivan sen varhaisvaiheissa.

AKTIVOITU-ETIKKAHAPPO, Acetyl-CoA sisältää aktivoidun 2 hiilen yksikön.(C2)
Aktivoitu asetoetikkahappo, ACETOACETYL-CoA sisältää kondensaattina kaksi etikkahappoa ja nyt hiilten määrä on 4.
Tähän liittyy vielä C2- yksikkönä yksi aktivoitu etikkahappo ja HMG-CoA syntaasi alkaa vaikuttaa. Vesimolekyyliäkin tarvitaan reaktioon.
Muodostuu kondensaaatti , jossa on kuusi hiiltä (C6): Sen nimi on Beeta- HYDROXY-beeta-METHYL GLUTARYL-CoA ja se on nyt kolmesta etikkahaposta vesimolekyylin avulla kondensoitunut molekyyli, jonka lyhennys on HMG-CoA. (C6) Kolesterolin muodostusta koetetaan tästä alkuvaiheesta jarruttaa ennen kuin tämä ehtii muuttua mevalonaatiksi. Mutta jos tätä molekyyliä HMG-CoA kertyisi liikaa, on mm rhabdomyolyysin tai lihaskipujen vaaraa ja jotkut kolesterolia-alentavat lääkkeet eivät olekaan onnistuneet lihaskudos ym vaikutusten takia.
Seuraava reaktio olisi HMG-CoA reduktaasi, jonka tuloksena tulee MEVALONAATTI-molekyyli. Esim statiinit koettavat jarruttaa reduktaasia, jotta mevalonaattia ei pääsisi niin paljon muodostumaan.
Tästä vaiheesta MEVALONAATTI-molekyyli voi tarvittaessa vielä pilkkoutua aktiiviksi etikkahapoksi takaisin ja liittyä kehon tärkeään aktiivin etikkahapon aitioon Acetyl-CoA ( muuttua sitten esim energiaksi tai siirtyä pitkien rasvahappojen synteesin puolelle) TAI ketoositilanteessa vain asetoetikkahapoksi, joka voi muuttua beeta-voihapoksi ( molemmat sellaisia puolipalaneita ketotuotteita). Maksa ei kuitenkaan tätä asetoetikkahappoa käytä, vaan se joutuu extrahepaattisiin kudoksiin, jotka ainoastaan voivat aktivoida siitä asetoasetyyli-CoA muotoa ja nyt se kelpaa taas pitkien rasvahappojen tai /ja kolesterolin synteesiin. Myös aktiivi meripihkahappo pystyy aktivoimaan asetoetikkahapon aktiiviksi asetyylietikkahapoksi takaisin. Täten on aika varmaa, että on hyvät lähtökohdat saada molekyylejä pitkien rasvahappojen synteesiin ja samalla välillä mevalonaattitiehen. Tämän tärkeän asetoetikkahapon hyödynnys on ihmisellä hyvä. Evolutionaalisesti ihmisen keho suosii rasvaenergian varastoimista joko neutraalirasvoina, jonne siirretään pitkiä rasvahappoja glyserolitumaan tai kolesterolin puolelle ja näihin erilaiisiin isoprenyaatiotuotteisiin - ne eivät olevarsinaisia energia-aineita vaan funktionelleja. Koelterolikin pitää erittää pois kehosta. Ne kuuluvat myös kehon luonnolliseen tärkeään puolustukseen, uloiseen ”nahkaan”, ihoon, solumembraniin, vedenpitävään puolustukseen.Myös luonnolliseen immuniteettiin.
MEVALONAATTIA saadaan HMG-CoA molekyylistä, kun siitä poistuu Koentsyymi A. mikä on helppo reaktio. : www.med.unibs.it/~marchesi/cholest.html

MEVALONAATTI Molekyyli on tosi sopiva solukalvon lipidiankkuripohjan tekijäksi.

Jos fosforyloitu mevalonaatti dekarboksyloituu C5- hiiliseksi, ollaan isopentenyylipyrofosfaatissa. (IPP) Nyt on saatu tärkeä perusmuoto IPP, josta voidaan saada luonnosas hyvin yleisiä isoprenoidi -yksikköisiä rakenteita ( lego-tapaisesti) , kun niitä kondensoidaan keskenään eri mittaisiksi molekyyleiksi, joille löytyy taas omat odottavat entsyymityövälineistöt, kun tietty mitta on koossa.

Miksi isoprenoidirakenne on tärkeä?

Fosfolipidikaksoiskerroksessa on keskimmäinen kerros vedenpitävää kolesterolia, mutta jos se olisi pelkästään kolesterolia, se olisi aika tankea, mutta kolesteroli-puusta tulee muitakin rakenteita, jotka moduloivat kolesterolin steroidista tumaa ja vastavaikuttavat kolesterolin tankeuteen. DOLIKOLI on KOLESTEROLIN vastavaikuttaja kalvon pitämisessä fluiditeetilta sopivana. Lisäksi dolikoli kalvon keskivaiheilla muodostaa miljöötä, jonne vastaavan hahmoisia isopreenisivuketjuja asettuu, kun eri aineet ankkuroivat kalvoon

Tällä isoprenoidisella rakenteella voidaan molekyyleille tehdä sellaisia ankkureita, joitten avulla molekyylit pystyvät pysyttelemään kiinni solukalvossa eri pitkiä aikoja kuten vitamiinit. Sen takia monet vitamiinit omaavat pitkän isoprenoidisen sivuketjun, kuten E-vitamiini, kaikki K-vitamiinit, A-vitamiini, betakarotenoidit ja iso määrä kasvisflavonoideja ja antioksidantteja, ubikinonit. K1- fytyylisivuketju oksidoituu aika nopeasti, joten lyhyeksi muuntunut tähde metylnaftokinoni onkin xenobioottinen, joka nopeasti poistuu kehosta. K1- vitamiinin varasto on yhtä suuri kuin päivä tarve. Menakinonit sensijaan pysyttelevät kauemman aikaa kehossa pitkine sivuketjuineen, kuten esim maksassa ja luustossa.

Menakinonin isoprenoidissa on kaksoisidoksia useampia. K1 vitamiinin sivuketjussa on 1 kaksoissidos. Mm aivoissa kuitenkin on entsyymeitä, jotka muuntavat K1 vitamiinia menakinoni-4 muotoon, joka on mieto K2-vitamiini, aivokudoksen suosima koko.

Ubikinonin sivuketju syntetisoidaan kehossa , ihmiselläkin, ja kondensoidaan vaikuttavaan molekyyliin ubikinoniksi.

Kolesterolilla on paljon tehtäviä, joista yksi on sijaita fosfolipidikaksoiskerroksen sisällä. Jos nyt kolesteroliongelmien takia joudutaan manipuloimaan koko mevalonaattitietä ja isoprenoidiankkureitten saaminenkin (dolikoli-P) herättää kysymyksiä, voidaan asiaa korjata pitämällä huolta kasvisperäisistä antioksidanteista ja bioflavonoideista ravinnossa, jolloin isoprenyloituja molekyylejä saadaan kuitenkin riittävästi solukalvoihin. Täysin ei ravintoperäistä kolesterolilisääkään pitäisi eliminoida. Esim pari kananmunaa viikossa ainakin on aivan sopivaa. Eikä "yksi muna päivässä" liene liikaa. Exogeeninen kolseteroli ilmeisesti negatiivisesti säätää endogeenisen kolesterolin tuotantoakin, sillä keho tarvitsee tietyn määrän kolesteroliaan joka päivä kaikkien solujen ja kalvorakenteiden ylläpitoon.

Mevalonaattitie näihin sivuketjuja antaviin ryhmiin on seuraava.

Tulee huomata että tämä on luonnossa yleinen molekyyli, mutta ihmisellä esiintyy vain vain muutamia isopreenirakenteita ja muutamia aineenvaihdunnallisia teitä. Ilman mevalonaattitietä ihminen ei pysty muodostamaan isopreeneja, kuten kasvit tai bakteerit taas puolestaan pystyvät.

Ihmisellä toimii tällainen sekvenssi tapahtumia.

MEVALONAATTI

ISOPENTENYYLI-PP (IPP)

GERANYYLI-PP (GPP)

FARNESYYLI-PP (FPP). Sivutiet: FARNESOLI (FOH), DOLIKOLI, UBIKINONISIVUKETJU, ANKKURIT

GERANYLGERANYYLI-PP (GPP): tiettyjen mielellään prnyloituvien PROTEIINIEN ANKKURI

SKVALEENI

KOLESTEROLI ( Kolesterolista tulee sitten myös hormoneita, joilla on steroidirakenne)

ISOPREENI CH2=C(CH3)-CH=CH2

Tämä on tavallinen viiden hiilen rakenneyksikkö luonnossa. Kasvit ja eläimet käyttävät sen aktivoitua pyrofosfaattimuotoa
( IPP)

ISOPENTENYYLI-PP, CH2 =C(CH3)-CH2-CH2-PP

Tässäkin on viisi hiiltä (5C). Bakteereissa ja vihreissä levissä ja kloroplasteissa tätä voi muodostua aivan ilman mevalonaattitietäkin ja silloin se muodostuu suoraan kondensoitumalla hydroksietyylitiamiini pyrofosfaatista ja glyseraldehydi 3-fosfaatista. Se aineenvaihdunnallinen tie, mitä silloin käytetään, menee D-1-xyluloosi 5-fosfaatin kautta Tuotetta bakteerit ja kasvit taas käyttävät isoprenoidiensa syntetisoimiseen. Mutta ihmisellä tarvitaan mevalonaattitietä.

LUONNON TERPEENIT MUODOSTUVAT NÄISTÄ ISOPRENOIDEISTA

Hyvin suuri ryhmä orgaanisia kasviyhdisteitä on rakenteeltaan terpeenejä, ja niitä jaetaan monoterpeeneihin (C10) , seskviterpeeneihin (C15) ja diterpeeneihin (C20) sen mukaan miten ne koostuvat.

Terpeenien biosynteesi tapahtuu intramolekulaarisella prenylaatiolla ja se alkaa geranyyli-PP molekyylistä käsin (GPP) tai farnesyyli-PP.stä (FPP) tai geranyyligeranyyli-PP.stä käsin Kun nyt sitten johdetaan jokin hydroksyyliryhmä (-OH) tai karboksiryhmä (C=O) molekyyleihin, syntyy suunnaton määrä erilaisia yhdisteitä Monet niistä ovat aromaattisia ja joillain on havaittu lääkkeellisiä ominaisuuksia, esim. antimalarialääkkeitä on niistä löytynyt.

MONOTERPEENEITÄ (C10) muodostuu geranyyli-PP: stä, neryyli-PP.stä ja linalyyli-PP:stä käsin. esim. geranioli, limoneeni, alfa-pineeni, kamferi, teresantoli. Näitä on vain evoluution korkeimmissa kasveissa ja ne ovat haihtuvia, ominaistuoksun omaavia, useimmiten niissä ei ole happea.

SESKVITERPEENEJÄ (C15) muodostuu farnesyyli-PP:stä, joskus nerolidyyli-PP:sta. Niitä ovat farnesoli, kurkumeeni (curcumene), cadineeni ja cedreeni. Näitä esiintyy sellaisilla lajeilla kuin tracheophyta, sammaleet, sienet, ruskeat ja punaiset levät, hyönteiset. Niitä on eteerisiä öljyjä, myös kasvien hormoneja kuten phytoalexiinit, hyttysten varhaismuotojen hormoneja.

DITERPEENIT (C20) muodostuvat geranyyligeranyylistä käsin. Niitä ovat fytoli, kauruunihappo, abietiinihappo. Niitä on kasveissa ja sienissä ( fungi). Nämä ovat osina resiineissä ja balsameissa. Usein ne ovat hyvin oksidoituneita. Gibberreliinihappo ( Gibberelic acid), jota muodostuu kaureenista (kaurene), on kasvien kasvuhormoni.

ALL-TRANS-METABOLIITIT

KAROTENOIDIT ( Carotenoids), (C40) ovat muodostuneet kahdesta geranyyligeranyylimolekyylistä.

Evolutionaalisesti korkeat kasvit, hiivat ja levät tuottavat cis-phytoeeniä (cis-phytoene), joka muuttuu trans-muotoon myöhemmin. Mutta bakteerit tekevät trans-fytoeeniä suoraan. Kalvoon kiinnittyneet fytoeeni-desaturaasit oksidoivat ja syklisoivat fytoeenejä useissa vaiheissa ja niistä tulee all-trans- ALFA-ja BEETA-KAROTEENEJA.

Asteittaisella oksidaatiolla kasvit ja bakteerit muuttavat niitä XANTOFYLLIINEIKSI, jotka toimivat valoa absorboivina fotosynteettisinä pigementteinä kasveilla. Ne pystyvät myös eliminoimaan vapaita radikaaleja ja toimimaan kalvoa suojaavina aineina ja siinä ne vastaavat ihmisten E-vitamiineja.

BEETA-KAROTEENI voi katalysoitua dioksygenaasilla ja pilkkoutua symmetrisesti all- trans RETINOLIKSI Tämä yhdiste on taas selkärankaisille - kuten ihmiselle- välttämätön näköprosessissa (visual process). Soluissa RETINAALI on tasapainossa all-trans RETINOLIN kanssa (A-VITAMIINI). Solujen välinen kuljetus ja jakautuminen edistyy spesifisten retinolia sitovien kompleksien avulla, kuten RBP, CRBP II, IRBP), kun taas varastoituminen ja otto ravinnosta tapahtuu retinoli-rasvahappoesterien muodossa. Toisaalta pieni määrä RETINAALIA oksidoituu RETINONIHAPOKSI ( Retinoic Acid). Tätä yhdistettä kuljetaan hyvin spesifisenä kompleksina solujen retinonihappoa sitovana proteiinina (CRABP, Cellular Retinoic Acid Binding Protein). Retinonihapolla on hormonin kaltaisia ominaisuuksia solujen kehityksessä ja solun jakaantumisessa, minkä se vaikuttaa tiettyjen tumareseptoreitten (NRs, Nuclear Receptors) kautta. Promyelosyyttisessä leukemiassa (PML) sitä annetaan cancerostaattisena lääkkeenä. BEETA-KAROTEENIT ovat tärkeitä myös immunologisen puolustuksen kehittymisessä ja arterioskleroosin estämisessä.

RETINOIDIEN katabolia tapahtuu konjugoitumalla glukuronihappoihin ja erittymällä virtsaaan.

POLY-Cis-METABOLIITIT: DOLIKOLI, TEIKOHAPPO ja LUONNNONKUMI

Ihmisessä on DOLIKOLIA.

DOLIKOLI-P (C70----C120) on aivan essentielli molekyyli ihmisellä, sillä se toimii fosforyloituna ollessaan sokerirakenteitten kantajana animaalisessa kehossa solun pintakalvossa, kasveilla ja sienillä, kun muodostuu GLYKOPROTEIINEJA (gp) endoplasmisessa retikulumissa (ER). Edelleen dolikyyliesterit toimivat rasvahappojen kuljetuksissa ja varastoitumisissa.

Pyrofosforyloidusta Cis GGPP tiestä, sanoo Michal, (mutta moni muu lähde FPP-tiestä), lähtee kehittymään DOLIKOLI ja siinä välittää hyvin hanakkaasti toimiva entsyymi polyprenyyli-cis-transferaasi.

BAKTEEREILLA on LPS ja TEIKOHAPPO ( teichoic acid)

Bakteerit käyttävät undekaprenyyli-P (C55) muotoa glykopeptidiensä kuljettajana, kun ne muodostavat soluseinämänsä mureiinia ( MUREIN).

Se toimii myös sokerien kantajana muille bakteerikalvon komponenteille, kuten LIPOPOLYSAKKARIDEILLE (LPS) tai teikonihapoille (TEICHOIC ACIDS). Molemmat yhdisteet kantavat 2-3 kaksoissidosta, jotka sijaitsevat trans-konfiguraatiossa niiden non-hydroksyylisessä päässä.

LUONNON KUMI

Isopentenyyli-PP (IPP) on alkulähtökohta luonnon kumeille ( esim lähteestä Hevea brasiliensis)., jotka sisältävät hyvin pitkän all-cis isoprenoidi ketjun (C 3500---- C25000).

ISOPRENOIDI-SIVUKETJUT OVAT TÄRKEITÄ VITAMIINEISSA

Bakteerien pigmenteissä ja kasvihormoneissa, cytokiniineissä, on isoprenoidisivuketjuja.

FYTYYLI-PP (C20) muodostuu all-trans-geranyyligeranyyli-PP:stä kasveilla ja eräillä bakteereilla.

FYTYYLI toimii KLOROFYLLISSÄ sivuketjuna.

Se on myös alfa-TOKOFEROLIN eli E-VITAMIININ sivuketju.

K1- VITAMIINI eli FYLLOKINONI, käyttää FYTYYLI- sivuketjua myös.

Pitempiä isoprenoidisia sivuketjuja on läsnä K2-vitamiineissa, joita sanotaan MENAKINONEIKSI ( C20----C30).

Samoin UBIKINONIN sivuketju on pitkä C30---C50). Tätä valmistuu ihmisessä mevalonihappotiestä.

Bakteereitten hengityksessä on tärkeitä menakinonit ja/tai ubikinonit. Joillain bakteereilla on hyvin monen pituisia menakinoneja kuten stafylokokeilla, joilla kaiketi on bakteereista suurin kirjo menakinoneja. Bakteereita voi lajitella niitten menakinoni- ja ubikinoni tyyppien mukaan.

Kasvien hengityksessä tärkeä on PLASTOKINONI ja sen koko on C45.

MONET PROTEIINIT liittyvät solukalvoihin ISOPRENOIDI-ANKKUREILLA.

Tio-eetterisidoksella useimmiten liittyy proteiini farnesyliin, joskus myös geranyyligeranyyliketjuun.

ESIM. Ras proteiini, G gamma-proteiinit ja Heme-A ovat tällaisia proteiineja.

Tämä prenylaatio määrää proteiinin sijoittumisen ja funktion.

fredag 14 december 2018

Proteiinigeranylgeranylaation tärkeys luonnollisessa immuunivasteessa (Thesis, Akula Murali)

Päivän väitöstilaisuus oli klo 13 -16 välillä. Sali oli miltei täynnä kuulijoita.

Thesis-kirjoja kuitenkin riitti, vaikka tulin aivan tasalta laitokselle.

Vastaväittäjänä toimi USA:sta Pohjois-Carolinan Yliopiston Lääketieteellisen instituutin Biokemian ja Biofysiikan professori Sharon Cambell. Koetan koota lyhyesti sen, mitä käsitin väitöksestä.

Professori Cambell antoi väitöksen aihepiiristä laajaa yleiskuvaa:

Kyseessä oleva metabolinen tie on aktiivista etikkahaposta päin entsymaattisesti muodostuvien proteiinein ketju ja eräs päätetuote synteesiketjusta on kolesteroli ja sen johdannaiset, mm erilaiset hormonit. Koska liian korkeat kolesteroliarvot ja ja sydänverisuonitaudit ovat maailmassa suuri rasitus, juuri tähän sytnteesitiehen on kohdistettu muutamia lääkkeitä, kuten kolesterolia-alentavien lääkkeiden arsenaali. Näistä tunnetummat lääkkeet ja yleisimmin käytetyt ovat statiinit. Ottaen huomioon että sydäntauti kuolleisuus esim Ruotsissa on päivän METRO:n n mukaan 50 infarktia päivittäin, jouluisin 70, statiinien ja muiden kolesterolin hallintaan tarkoitettujen lääkkeiden asema lääkelistoilla on ja pysyy vakaana.

Lisäksi on havaittu että tämä mainittu metabolinen synteesitie osallistuu myös syövän syntyyn, Amerikkalainen professori valaisi asian tutkimisen tärkeyttä, sillä USA:ssa kuolee vuosittain syöpään 609 640 kansalaista, mikä merkitsee kolmea jumbojetillistä ihmisiä päivittäin.

Verrattuna tilanteeseen, joka vallitsi 1977, on syövän diagnostiikka ja hoito kohentunut kovasti, joten 5 vuoden elossapysyvyys on selvästi parantunut, 20%.

Mitä tulee syövän hoitoon, ne ovat perinteisesti kirurgiaa, sädehoitoa, kemoterapiaa, hormoneja, immunoterapiaa, täsmennettyä immunoterapiaa. Konvemtionellit syöpäterapiat ja lääkkeet ovat sytotoksisia, ne ovat myrkkyjä, jotka eivät tee eroa terveen solun ja syöpäsolun välillä , mikä haitaa potilaiden selviytymistä. Sen takia on tärkeää tutkia keinoja, joilla voitaisiin löytää niin täsmällistä syöpäsolua tuhoavaa strategiaa, että normaalit solut eivät kärsisi, vaan oman kehon immuunivaste vahvistettuna voisi itse alkaa tuhota syöpäsoluja. (Ollaanhan immuno-onkologian aikakaudessa!)

Päivän väitösaiheen metabolinen tie johtaa mevalonihaposta käsin isopreenirakenteisiin kuten farnesyyliin ja geranylgeranyyliin. ( ennen kuin muodostuu skvaleeni ja kolesterolia).

Nämä proteiinirakenteet ovat tärkeitä sillä ne ovat hydrofobisia ja solukoneiston eräät proteiinit tarvitsevat rasvaliukoista liitettä posttranslationaalisesti päästäkseen pysymään solukalvossa ja pysymään aktiivina.

Tirdetään eräs proteiinisuurperhe, ne ovat pieniä GTP-aaseja ja ne tarvitsevat tällaista prenylaatiota: RAS-superperhe.

On havaittu, että 30%:ssa syövistä on tapahtunut RAS- geenin mutaatio, mikä tekee juuri tämän proteiiniryhmän syöpätutkimuksissa kiinnostavaksi. RAS- geeni oli sitäpaitsi ensimmäinen geeni, joka oli havaittu ihmisen onkogeeniksi. Tuumoriperäinen RAS koaktivoituu yhden ainoan aminohapon susbtituutiosta. RAS on onkogeeninen käynnistäjä. Yhtä syöpää kohden on todettu noin 80 mutaatioita, mutta useimmat niistä ovat harmittomia. On olemassa anti-RAS- lähestymistapa lääkekehittelyssä ja se on kliinisen kokeen vaiheessa. RAS - prosessoituminen on avainfunktio, johon kohdistetaan.

On olemassa jo farnesyylitransferaasi-inhibiittoreita (FTI). RAS onkogeeneja on kolme, esim. KRAS ja HRAS. Niistä HRAS on eniten FTI-sensitiivinen ja KRAS vähemmän sensitiivinen Geranylgeranyylitransferaasi1 ei modifioi HRAS-onkogeenia , mutta se pystyy modifioimaan KRAS-onkogeenia. Tämän takia on kiinnitetty nyt huomiota geranylgeranylaatioon ( On tutkittu kaksoisprenylaatio-inhibiittoreiden mahdollisuutta). KRAS- onkogeenistä on tarkempi kuvaus väitökirjassa.

Väitöskirja pureutuu yksityiskohtiin RAS-superperheen jäsenten prenylaatiotapahtumissa, sillä eri jäsenten prenylaatioden kesken on eriävyyksiä ja vuorovaikutuksia, joita on selvitettävä, jotta saadaan käsitystä siitä, miten ja mitä täsmä lääkettä pitää kombinoida ja mihin prosessikohtaan kohdentaa. Saattaa olla vielä tuntemattomia vaikuttajaentsyymeitäkin ja kofaktoriproteiineja.Tutkija oli seulonut 700 proteiineista mahdollisia vaikuttajia esiin.

Statiinin merkitystä punnittiin.

Mikä vaikutus on kolesterolisynteesin estoon tarkoitetulla mevalonaattitien ylävirrassa tapahtuvalla prenylaatiotien statiinivaimennuksella näihin RAS-superperheen proteiinien keskinäisiin vuorovaikutuksiin, tasapainoon ja funktiokarttaan? Kun kolesteroli onnistutaan laskemaan, mitä tapahtuu prenylaatiokartalla? Mitä vaikutuksia havaitaan heijastuvan kehoon?)

Prenylaation merkitys näille pienille GTPaaseille on vaikutusajan pidentyminen. Kun ne saavat lipidiankkurinsa prenylaatiosta, ne pysyvät kauemman aikaa vaikuttamassa, aktiivina , ”ON”. . Jos prenylaatio blokeerattiin seurasi RAC1-effektoreitten interaktioita ja tulehduksellinen signalointi käynnistyi ja se oli haitallista. Prenylaatiolla olitäten merkitystä luonnollisen immuniteetin ärhäkkyyden suitsemisessa , sillä RAC1:n ollessa prenyloituneena sen interaktiot vaikuttajiin estyivät, kertoo väitöskirja.

On uutista niveloireiden puolelta kuten synoviittia ja pahaa nivelreumaa. Statiinista tiedetään myosiittititapauksia. Tulee mieleen, että statiini saattaa olla sellainen ”haulikolla variksia” ampumista, josta sitten ”harhahaulit” aiheuttavat asioita, joita pitää kartoittaa myös. Mutta tämä prenylaatiopuolen kartoitus on vasta menossa, kun taas statiinien edut on ja nähty ja lääkekandidaatit voat kokeiluvaiheissa.Statiinine edut taas jo näkyvät nopeissa akuuteissa sairauksissa, mutta prenylaatiopuolen vikasäätö heijastuu onkologian katalasti näkymättömään alueeseen.

Uusi väitöskirjamäärittelee proteiiinin geranylgeranylaation tärkeyttä luonnollisessa immuniteetissa.

http://hdl.handle.net/2077/57427

Väitöskirjaan kuuluvat osatyöt:

Akula MK, Shi M, Jiang Z, Foster CE, Miao D, Li AS, Zhang X, Gavin RM, Forde SD, Germain G, Carpenter S, Rosadini CV, Gritsman K, Chae JJ, Hampton R, Silverman N, Gravallese EM, Kagan JC, Fitzgerald KA, Kastner DL, Golenbock DT, Bergo MO, and Wang D. Control of the innate immune response by the mevalonate pathway. Nature Immunology. 2016; 17: 922–929.
VISA ARTIKEL

Akula MK, Ibrahim MX, Khan OM, Kumar TI, Erlandsson MC, Karlsson C, Xu XF, Brisslert M, Brakebusch CH, Bokarewa M, Wang D, and Bergo MO. Protein prenylation restrains innate immunity by limiting RAC1 effector interactions. Manuscript.

Väitöskirjan abstrakti:

RHO family proteins and other intracellular proteins are prenylated with a 20-carbon lipid—a product of the cholesterol synthesis pathway—by protein geranylgeranyltransferase type I (GGTase-I). Prenylation is widely believed to target proteins to membranes where they encounter effector molecules that stimulate GTP-binding and activation.

However, my host group found that knockout of GGTase-I in mouse macrophages (Pggt1bΔ/Δ) actually increases GTP-loading of RHO proteins such as RAC1, RHOA, and CDC42, and also increases proinflammatory signaling and cytokine production, and induces severe rheumatoid arthritis.

These results suggest that prenylation may inhibit rather than stimulate RHO protein function. The mechanisms underlying increased GTP-loading and exaggerated innate immune responses in the absence of GGTase-I are not known. During my PhD, I have addressed these issues in two independent but interconnected projects.

In project 1, we found that there is an imbalance between inflammatory and anti-inflammatory cytokines produced by Pggt1bΔ/Δ macrophages. We also found that knockout of GGTase-I prevents the interaction between KRAS and PI3K catalytic subunit p110δ and that this reduces signalling through the PI3K-AKT-GSK3β pathway.

Moreover, Pggt1bΔ/Δ macrophages exhibit increased caspase-1 activity that is directly responsible for the production of active interleukin IL-1β, and that this effect requires the MEFV (pyrin) inflammasome. Thus, we conclude that GGTase-I promotes an association between KRAS and p110δ and thereby controls major inflammatory pathways in macrophages.

In project 2, we tested the importance of RHO proteins in the development of arthritis in Pggt1bΔ/Δ mice. We found that knockout of Rac1 (i.e., in Pggt1bΔ/ΔRac1Δ/+ mice), but not Rhoa and Cdc42, markedly reduced inflammatory cytokine production and arthritis in Pggt1bΔ/Δ mice.

We also found that non-prenylated RAC1 bound more strongly to the RAS GTPase-activating-like protein 1 (IQGAP1) – which facilitated RAC1 GTP-loading and activation. Knockout of Iqgap1 in Pggt1bΔ/Δ mice abolished cellular phenotypes in vitro and inhibited arthritis in vivo.

Thus, we conclude that blocking prenylation stimulates RAC1 effector interactions and activates wide-spread pro-inflammatory signaling. Thus, prenylation normally restrains innate immune responses by inhibiting RAC1 effector interactions.

Muistiin 14.12. 2018 Jatkoa tulee vielä väitöstilaisuudesta.

fredag 12 oktober 2018

Kolesterolin kuljetus (NPC1) endoplasmiseen retikulumiin ja NLRP3-inflammasomin aktivoituminen

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6168277/

Trafficking of cholesterol to the ER is required for NLRP3 inflammasome activation.

Marianne de la Roche,^1,^* Claire Hamilton,^1,^* Rebecca Mortensen,¹ A. Arockia Jeyaprakash,² Sanjay Ghosh,³ and Paras K. Anand¹

Suomennosta abstraktista:

Solulipidit määräävät kalvointegriteetin ja fluiditeetin ja lisääntyvässä määrin niitä tunnistetaan immuunivasteeseen vaikuttavina seikkoina. Solun koleterolintarpeet täyttyvät biosynteesin ja soluunotto-ohjelman avulla. Eräässä hyvin mutkikkaassa tiessä, johon osallistuu lysosomaalinen kolesterolin kuljettaja NPC1, steroli jakauttuu epätasaisesti intrasellulaarisissa aitioissa. Tutkijat kohdistivat NPC1 -kolesterolinkuljettajaan tutkimuksia farmakologisin ja geneettisin lähestymistavoin ja he saivat selville, että kolesterolin kuljetuksen blokeeraaminen myöhäisen endosomin (LE)--lysosomin kuljetustiessä heikensi NLRP3-inflammasomin aktivaatiota.

(NLRP3 on NOD -kaltaisia reseptoreita NLR , jolla on PYD, NACHT ja LRR (leusiinitoisto) domeenit).

Muuntunut kolesterolin lokalisoituminen plasmakalvossa NPC1(-/-) mallissa poisti (kumosi) TLR4- reseptorin AKT/mTOR-signaloinnin.

Kuitenkin NLRP3-inflammasomin aktivoitumisen vajaakykyisyys johtui häriintyneestä kolesterolin kuljetuksesta endoplasmiseen retikulumiin (ER) ( eikä siis plasmakalvoon).

Sen mukaan statiinin vaikuttama akuutti kolesterolin vähenemä ER- kalvoista kumosi caspaasi-1- aktiivisuuden ja Il-1Beta-sekretion sekä irrotti NLRP3 -inflammasomin koostumuksestaan.

Päinvastoin AIM2-inflammasomi suoritti koostumisen ja aktivaation progression ilman rajoitusta.

Yhteenvetona tutkimus selvittää Endoplasmisen retikulumin (ER) sterolipitoisuudet metaboliseksi reostaatiksi NLRP3-inflammasomin aktivaatiossa.

Abstract. Cellular lipids determine membrane integrity and fluidity and are being increasingly recognized to influence immune responses. Cellular cholesterol requirements are fulfilled through biosynthesis and uptake programs. In an intricate pathway involving the lysosomal cholesterol transporter NPC1, the sterol gets unequally distributed across intracellular compartments. By using pharmacological and genetic approaches targeting NPC1, we reveal that blockade of cholesterol trafficking through the late endosome–lysosome pathway blunts NLRP3 inflammasome activation.

Altered cholesterol localization at the plasma membrane (PM) in Npc1^−/− cells abrogated AKT–mTOR signaling by TLR4. However, the inability to activate the NLRP3 inflammasome was traced to perturbed cholesterol trafficking to the ER but not the PM. Accordingly, acute cholesterol depletion in the ER membranes by statins abrogated casp-1 activation and IL-1β secretion and ablated NLRP3 inflammasome assembly. By contrast, assembly and activation of the AIM2 inflammasome progressed unrestricted. Together, this study reveals ER sterol levels as a metabolic rheostat for the activation of the NLRP3 inflammasome.

Introduction

The inflammasome is a multiprotein complex that plays critical roles in infectious, inflammatory, and autoimmune diseases. The NLRP3 inflammasome is the most characterized inflammasome in terms of the diverse stimuli that are known to activate it. Activation of the NLRP3 inflammasome requires assembly of NLRP3 and caspase-1 (casp-1) bridged together through the adaptor protein ASC, wherein casp-1 undergoes autoproteolytic processing. Subsequently, active casp-1 cleaves precursor forms of cytokines interleukin (IL)–1β and IL-18, which can then be secreted (; ). Casp-1 also cleaves gasdermin D (GSDMD), making its N-terminal pore-forming domain active, leading to cell rupture (; ). Distinct exogenous, endogenous, and environmental stimuli are known to activate the NLRP3 inflammasome, implying that these stimuli do not bind NLRP3 directly but likely converge on shared upstream pathways. The mechanistic details of NLRP3 activation remain ambiguous.

Lipids are known to carry out diverse functions within cells, including being a major component of cell membranes, and as signaling messengers. Cholesterol is an essential lipid in mammalian cell membranes aiding varied functions, the most fundamental of which are membrane integrity and fluidity (). Levels of cholesterol in the cell are maintained through de novo synthesis in the ER, and uptake of low-density lipoproteins (LDLs) derived from dietary cholesterol. Excess free cholesterol can be toxic to cells; thus, sterol homeostasis needs to be integrated by a combination of cholesterol uptake, biosynthesis, and efflux programs. At the subcellular level, cholesterol follows an intricate pathway in cells (). Exogenously obtained LDL bound to LDL receptor is internalized at the plasma membrane (PM) and is transported through the endocytic pathway to the late endosomes–lysosomes, where cholesterol esters within the LDL core are hydrolyzed by acid lipases. Unesterified or free cholesterol translocates through the lysosomal cholesterol transporter Niemann-Pick C1 (NPC1) to other cellular sites such as the PM and the ER. In the ER, cholesterol can be reesterified, permitting cytoplasmic storage in the form of lipid droplets.

Until recently, cholesterol has mostly been accepted to have an influence on immunity during pathological conditions such as in atherosclerosis (). However, evidence suggests that homeostatic lipid metabolism and trafficking directly regulate the inflammatory pathways in macrophages. For example, defective lipid trafficking in the absence of NPC1 leads to the lysosomal storage disorder Niemann-Pick disease (). Mutations in the cholesterol efflux transporter, ABCA1, give rise to signs and symptoms of Tangier disease (). Similarly, perturbations in lipid metabolism contribute to several human pathologies including cardiovascular, obesity, and neurodegenerative diseases (). In addition to contributing to the pathogenesis of several diseases, cholesterol is also exploited by pathogens for their entry and proliferation within host cells. Several pathogens that lack the capacity for de novo sterol synthesis use cholesterol for their survival and replication by either increasing host lipid biosynthesis or redirecting cholesterol transport pathways (; ; ; ; ). These studies suggest that reducing lipid synthesis may serve to limit nutrients available to pathogens, thus benefitting host cells. Conversely, host cells need lipids for mounting a robust immune response to infection through conserved pattern recognition receptors (; ). Together, these studies lead to the hypothesis that lipid homeostasis is critical for an effective inflammatory response with implications for homeostatic lipid trafficking in both infectious and inflammatory diseases. Whether perturbations in homeostatic cholesterol trafficking pathway impact inflammasome activation remains unknown.

In this study, by using pharmacological and genetic tools, we demonstrate that selective perturbation of the cellular cholesterol trafficking in macrophages ablates inflammasome activation. Mechanistically, perturbed sterol trafficking in Npc1 deficiency leads to two distinct effects: altered PM cholesterol levels resulted in inhibition of the AKT–mTOR pathway, while reduced cholesterol trafficking to the ER blunted NLRP3 inflammasome assembly. Accordingly, acute cholesterol depletion in the ER by statins decreased IL-1β secretion, which could be restored by supplementing with exogenous cholesterol. Our findings thus implicate sterol synthesis and distribution as critical factors influencing the activation of the inflammasome, thereby coupling lipid homeostasis to innate immune signaling.

---

Activation of inflammasome is characterized by cell swelling and subsequent osmotic lysis in the form of pyroptotic cell death following GSDMD cleavage (; ). In control cells primed with either LPS or Pam3, stimulation with ATP caused pyroptotic cell death. However, upon exposure to U18666a, cell death, and thus the secreted levels of cytosol-localized cell death marker, lactate dehydrogenase (LDH), were markedly diminished (Fig. 1, G–I). Overall these results demonstrate reduced casp-1 activation, IL-1β and IL-18 secretion, and decreased pyroptosis when cellular cholesterol trafficking is inhibited.

...

We next performed experiments to determine the role of priming in our assays.

Activation of the NLRP3 inflammasome requires two signals.

(1) The first signal, which potentiates the NLRP3 inflammasome, is provided upon Toll-like receptor (TLR) ligation and results in the synthesis of pro–IL-1β and up-regulation of NLRP3 expression (). This first signal (also known as the priming step) is dependent on the transcription factor NF-κB (; ).

(2) The second signal, which is more robustly provided by purinergic receptor P2X₇ agonist ATP, results in the assembly of NLRP3, casp-1, and adaptor protein ASC to form a multiprotein complex ().

...

A diverse array of signals is known to activate the NLRP3 inflammasome.

In contrast, ligands that activate the NLRC4 and AIM2 inflammasomes are well defined.

The NLRC4 inflammasome is triggered by the recognition of cytosolic flagellin and components of the bacterial secretion system by upstream NAIP family members (; ; ).

AIM2 inflammasome, in contrast, is activated by recognition of double-stranded DNA of ∼80 bp in length ().

Cholesterol supplementation restores inflammasome activation

Variation in the levels of cholesterol and other lipids within the cell are sensed by master transcriptional regulators SREBP1 and SREBP2, which, respectively regulate fatty acid and cholesterol biosynthesis (). A feedback mechanism tightly regulates cholesterol de novo biosynthesis to maintain homeostatic levels. Cholesterol depletion triggers ER resident sterol cargo protein SCAP to escort SREBP2 to the Golgi, where the precursor is cleaved to activate cholesterogenic genes. By contrast, in cholesterol-replete cells, conformational change in SCAP promotes insulin-induced gene–mediated retention of SREBP2 in the ER.

Picture:

---

F) Homeostatic cellular cholesterol trafficking to the ER is required for optimal inflammasome activation. Exogenously obtained LDL bound to LDL-R is endocytosed at the PM. Cholesterol efflux from the late endosome–lysosome compartment to other cellular sites such as the PM and the ER is dependent on NPC1. (G) Blockade of the cholesterol transporter NPC1 leads to lysosomal cholesterol accumulation and a subsequent decrease in cholesterol pool in both the ER and the PM. This in turn leads to decreased phosphorylation of AKT and mTOR following TLR ligation, causing a reduction in SREBP2-dependent lipogenesis. Additionally, perturbation in the ER cholesterol levels leads to decreased association of NLRP3 and ASC, resulting in reduced active casp-1 levels and IL-1β secretion. Furthermore, inhibition of ER cholesterol levels by statins similarly blunts NLRP3 inflammasome activation. LDL-R, low-density lipoprotein receptor; mTOR, mammalian target of rapamycin; SREBP2, sterol regulatory element binding protein 2.

Etiketter

Sidor

Leta i den här bloggen