Prenylaatio Geranylgeranylaatio. Rab-proteiinit

Rab- proteiini vaatii prenyloitumista, geranylgeranylaation.

Se kuuluu Ras- superperheesen, jotka ovat pienien GTPaasien superperhe.
Small GTPase > Ras superfamily
Niitä ovat
Ras • Rab (Rab27) • Arf (Arf6) • Ran • Rheb • Rho family (RhoA, RhoB, CDC42, Rac1) • Rap

I Rab- SIGNALOINNISSA ON OLENNAISTA seuraavat tapahtumat.

Rab-GTPaasien kohdentaminen effektoriproteiinille ( vaikuttajaproteiinille)

(1) Rab GTPaasit voivat geranylgeranyloitua kahteen kysteiinitähteeseen (Cys) ja aivan samalla tavalla kuin Rho-GTPaasit, ne voivat olla sytosolissa GDI-sitoutuneena ( GDI on GDP-erkanemisen estäjä , (GDP-dissociation inhibitor) ja sitoo prenyyliryhmiä inaktiivista GDP-sitoutuneesta Rab- molekyylistä. (GDI sitoo vain inaktiivia Rab- muotoa).

(2) Rab-proteiinit voivat muodostaa trimeeri-kompleksin, jossa on Rab, GDI ja kalvoon liittynyt GEF. Tätä kompleksiliittymää voi välittää Rab-proteiinin hypervariaabeli domeeni.

(3) Kun sitoutumista tapahtuu, Rab-proteiinin prenyylisivukejtu siirtyy GEF:molekyyliin päin. GDP/GTP-vaihtumistekijä ( exchange factor)= GEF katalysoi konversiota GDP-muodosta GTP-muotoon.

(4) Samalla kun Rab aktivoituu, erkanee GDI molekyyli ja Rab- prenyyli vetäytyy siitä pois.

(5) Kun GDI on irronnut , niin( aktiivimuoto) GTPaasi on siten esillä että se voi sitoutua GEF:ään ja effektoriproteiiniin, jolloin on muodostunut aktiivi Rab- signalointikompleksi. plasmakalvolla. (Rab-effektori sitoo ainoastaan aktiivia GTP Rab muotoa).

II
Eräs toinen lähde mainitsee sivumennen, että Rab- proteiini geranylgeranyloituu ja että farnesylaation estäjä FTI estää myös geranylgeranylaatiota.
Proteiinin prenylaatiosta ( farnesylaatiosta ) . Sovellutusta normaaliin fysiologiaan, maligniin transformaatioon ja syöpäterapiaan. Farnesyylitransferaasin inhibio (FTI) voi ulottua geranylgeranyylitransferaasin inhibitioon.

• LÄHDE: Saïd M. Sebti Protein farnesylation: Implications for normal physiology, malignant transformation, and cancer therapy Cancer Cell, Volume 7, Issue 4, 297-300, 1 April 2005

http://www.cell.com/cancer-cell/abstract/S1535-6108(05)00101-7

PROTEIININ FARNESYLAATIO on isoprenoidirakenteen, lipidin lisääminen posttranslationaalisena modifikaationa, mikä vaaditaan syöpää aiheuttavaan proteiiniaktiivisuuteen kuten Ras-GTPaasi toimintaan.

Vaikka FARNESYYLITRANSFERAASIN ESTÄJIÄ (inhibiittorieta, FTI) on jo kliinisessä kokeilussa niiden vaikutusmekanismi ja proteiinien farnesylaation osuus normaalissa fysiologiassa oli vielä 2005 aikaan tieteessä osin hämärä seikka.
Tässä viitteen lehdessä Cancer Cell kaksi artikkelia valaisee näitä tärkeitä aihepiirejä:
PROTEIININ FARNESYLAATIO havaittiin essentiaaliksi alkion varhaiselle kehitykselle (embryogeneesi), mutta sitä vailla taas voi aikuisen homeostaasi olla. Toisaalta prenylaatio on taas kriittinen tuumorigreneesin progredioinnille, mutta ei sen alkamiselle.
Lisäksi, Rab geranylgeranyltransferaasi (GGTase)
tunnistettiin muutamien FTI ( farnesyylitransferaasi-inhibiittorien) kohdemolekyylinä.
Tässä pienessä katsauksessa keskustellaan löytöjen sovellutuksista normaalin fysiologian, malignin transformaation ja syöpä terapian aloilla.

III Rab- proteiinista, pienestä G-proteiinista mainintaa
Lähde Wikipedia

• Rab

Rab-proteiiniperhe kuuluu Ras-superperheeseen, jonka proteiinit ovat monomeerisiä G-proteiineja.

On löydetty ainakin 70 eri tyyppistä Rab- proteiinia ihmiseltä.
Rab-GTPaasit

• säätelevät monia kalvokuljetuksen vaiheita ja niihin kuuluu
• rakkuloitten ( vesicle) muodostuminen
• rakkuloitten liikkuminen (vesicle movement) pitkin aktiini ja tubuliiniverkkoston kautta
• kalvofuusio ( membrane fusion).

Nämä prosessit tekevät sen reitin, jonka kautta solun pintaproteiinit (Cell Surface proteins) liikennöivät Golgin laitteesta plasmakalvoon (PM) ja sitten taas tekevät uudelleenkiertoaan ( recycle) .
Pintaproteiinien kierrätys palauttaa sellaisia proteiineja pintaan, joiden funktioon kuuluu kuljettaa jotain toista proteiinia tai substanssia solun sisään, esimerkisi transferriinireseptoria,
tai sitten ne toimivat tietyn tyyppisten pintaproteiinimolekyylien lukumäärän säätelykeinona.
Rab-proteiinit ovat perifeerisiä kalvoproteiineja ja se tarkoittaa, että ne ovat ankkuroituneena kalvoon lipidiryhmällään, joka on kovalenttisesti liittynyt aminohappoon. erityisesti kahteen C-terminaaliseen kysteiiniin.

• REP

Rab- escort protein, (REP) välittää vastasyntetisoitunutta ja prenyloitunutta Rab-proteiinia päätekohtaansa plasmakalvoon (PL) sitomalla hydrofobisia , liukenemattomia prenyyliryhmiä ja kuljettamalla Rab- proteiinia sytoplasman kautta. Lipidi-prenyyliryhmät voivat kiinnittyä kalvoon ja täten Rab ankkuroituu rakkulan sytoplasmiselle pinnalle tai plasmamembraanin. Koska Rab- proteiinit ovat ankkuroituneina kalvoon taipuvan C-terminaalisen alueen kautta niitten voi ajatella toimivan kuin ”pallo jousen päässä”, 'balloon on a string'.

(Kun on syntynyt uutta Rab- proteiinia, REP-Rab- kompleksi liityy katalyyttiseen dimeeriin Rab GGTaasi ( geranylgeranyltransefraasi) joka siirtää geranyyligeranyyliryhmän GG-PP molekyylistä Rab- proteiinille. Geranyloitunut Rab pysyy liittyneenä REP- eskorttiin ja kuljetetaan johonkin Rab- spesifiseen kohteeseen. Tämä tarkka kuljetus on aivan välttämätöntä alkion kehityksessä, embryogeneesissä).

Kuten muut GTPaasit Rab myös omaa vaihteen ( switch) kahden konformaation( struktuurin) kesken: "OFF", inaktiivin GDP- ( guanosiinidifosfaattiin) sitoutuneen muodon ja "OFF" ,  aktiivin GTP- (guanosiinitrifosfaattiin) sitoutuneen muodon välillä.

• GEF

GDP/GTP-vaihtumistekijä ( guanosiini nt.  exchange factor) CEF katalysoi konversiota GDP-muodosta GTP-muotoon.

• GAP

GTP ( energisimmän fosfaattimuodon) hydrolysoituminen GDP-muotoon on GAP-katalysoitua. (GAP= GTPase activating protein).

• REP- kuljettajat kuljettavat vain GDP-sitoutunutta Rab- muotoa.( Kohdeproteiineja ei kaikkia tiedetä).

• Rab- effektorit ( proteiinit joihin Rab on interaktiossa) ja joiden kautta ne vaikuttavat) sitovat ainostaaan GTP-sitoutunutta Rab- muotoa. Nämä Rab- effektorit ovat hyvin heterogeeninen ryhmä ja jokaisella Rab- isoformillakin on monia effektoreita, joitten kautta ne suorittavat monenlaisia funktioita.

Rab kierrättyy
Sen jälkeen kun Rab on ollut fusoitunut kalvoon, se kierrättyy uudestaan alkuperäiseen membraaniinsa.

• GDI GDP-erkanemisen estäjä , (GDP-dissociation inhibitor) sitoo prenyyliryhmiä inaktiivista GDP-sitoutunutta Rab- molekyyliä ja estää että se ei pääse aktivoitumaan ( että GDP ei muutu GTP-muotoon) ja johdattaa Rab molekyyliä alkuperäiseen kalvoonsa.

Jos proteiinin prenylaatio on viallinen, seuraa häiriöitä kuten esim chorioidemia

• Eri tyyppisiä Rab-proteiineja

Rab18
Rab1 (YPT1) ER, Golgin laite
Rab2 ER, cis-Golgin verkosto
Rab3A, eriterakkulat
Rab4, varhaiset endosomit
Rab5, varhaiset endosomit klatriinipäällysteiset rakkulat, plasmakalvo
Rab6, keski-Golgi ja trans-Golgi
Rab7, myöhäinen endosomi
Rab9, myöhäinen endosomi ja trans-Golgi
Rab11, uudelleen kierrättyvä endosomi, lipidipisarat, Golgi, ER
Sec4, eriterakkulat
Muita Rab- proteiineja
Rab6 Rab6a, Rab6b, Rab6c
Rab13
Rab27

Proteiinien prenylaatio (Ras/Rho esimerkkinä)

Proteiinin prenylaatio
Esimerkkinä proteiinin prenylaatiosta Ras-superperheen proteiini solusta.

Ras/Rho järjestelmä
Rho-proteiinit kuuluvat Ras-superperheeseen. Ras-superperhe vaatii prenylaation ankkuroituakseen.

Rho-perhe taas on GTPaaseja, joissa GDP-sitoutunut muoto Rho-GDP on inaktiivi ja Rho- GTP-on aktiivi.

Ras-proteiinit alternoivat inaktiivin ja aktiivin muodon välillä, mikä tekee niistä molekyläärisiä vaihteita( switch) signaaliteihin. , jotka koskevat kasvua ja erilaistumista ( differentaatiota).

PRENYLAATIO on prosessi, joka käsittää hydrofobisen isoprenoidiryhmän liittämisen Ras-proteiinin C-terminaaliseen päätyyn. Prenylaatiossa liittyy joko farnesyyli(F) tai geranylgeranyyli(GG) tähde Ras-proteiinin C-terminaaliin. (KTS. kuva missä Ras proteiini on ankkuroitunut plasmakalvon sisäpintaan. Ankkurikohta on tätä isoprenoidia)
http://www.nature.com/nrm/journal/v5/n5/images/nrm1365-f4.jpg
¨
MEVALONAATTI-tie antaa isopreenirakenteita kuten farnesyylipyrofosfaattia FPP ja geranyyligeranyylipyrofosfaattia GGPP ja niistä saadaan F- ja GG- tähde proteiinien prenylaatioihin. Siirtämisen tekevät entsyymit nimeltään prenyylitransferaasit.
Hydrofobi prenyyliryhmä ankkuroi Ras-superperheen proteiineja intrasellulaarisiin kalvoihin siten, että ne voivat translokoitua plasmamembraaneihin.
Lopullinen sijoittautuminen ja fiksoituminen solukalvoon on välttämätön Ras-proteiineille, jotta ne voisivat osallistua lopulliseen spesifiseen interaktioonsa..

STATIINI-lääkeaineet alentavat FPP ja GPP tuottoa ja jatkotuotteita, mitä tulee mevalonaattitiestä tarkoituksella kuroa kolesterolimolekyylin syntymistä. Näin STATIINIT ( riippumatta LDL:stä) vuorovaikuttavat solunsisäisesti Ras-superperheen proteiinien funktioon.
Muun muassa STATIINIT alentavat matrix-metalloproteinaasin MMP-1 ilmenemistä estämällä Rho-järjestelmää.
Jos STATIINI –lääke poistetaan, Rho-GTPaasi-geeni transkriptio vaikuttuu negatiivisella feedback säätelyllä ja nyt esim. endoteliaalisen NO molekyylin tuotto vaimenee.

(HUOM: Tämä Ras/Rho järjestelmä omaa laajan vaikutuskirjon, joka valkenee katsomalla erilaisia karttoja, missä eri signaaliteitä otetaan käsiteltäväksi)

http://www.nature.com/emboj/journal/v20/n4/abs/7593581a.html

Eräs teksti asiasta on tämänlainen:

Ras geeniä sanotaan onkogeeniksi, koska se vaikuttaa tumavälitteisesti monenlaisia muuntumisia, transformaatioita, jotka voivat olla myös maligneja.

”Ras-Onkogeenin välittämät transformaatiot vaativat Rho-perheen GTPaasi-funktiota
Ras- transformoiduissa soluissa on kohonnut pitoisuus RhoA-GTP, mikä toimii estämällä solusyklin inhibiittorin p21/Waf1 expressiota (the cell cycle inhibitor p21/Waf1)- siis "estää jarrua toimimasta".

Nämä korkeat Rho-GTP pitoisuudet eivät ole aivan suora seuraamus Ras-signaloinnista, vaan ne valiutuvat esiin vasteena jatkuvalle (sustain) ERK-MAP-kinaasi-signaloinnille.

Kun nyt korkeat Rho-GTP pitoisuudet kontrolloivat p21/Waf pitoisuuksia, ne eivät enää säätelekään aktiini-stressisäikeitten muodostumista transformoituneissa soluissa.

Tutkijat osoittivat, että (onkogeenisen Ras välitteisestä transformaatiosta johtuen ) ERK-MAP-kinaasin jatkuva päälläolo sääti vaimenemaan ROCK1 ja Rho-kinaasit. Nämä ovat kaksi effektoria, jotka vaaditaan aktiini-stressisäikeitten muodostukseen.

Kun nyt Rho-tekijästä riippuva aktiini-stressisäikeitten muodostus on vaimentunut ERK-MAPK signaloinnista, tämä vaikuttaa Ras-transformoituneissa fibroblasteissa lisääntynyttä motiliteettia( liikkuvaisuutta).
ROCK-kohdekinaasin LIM-kinaasin yliesiintymä voi ennallistaa stressisäikeet ja estää Ras-transformoituneitten fibroblastien motiliteetin.

Tässä tutkijat esittävät johtopäätöksenään, että Ras ja Rho signalointiteiden vuorovaikutus edistää sellaisia signalointiteitä, jotka suosivat transformaatioita.

(Rho kinase, a promising drug target for neurological disorders)

Tämä Rho/ROCK/LIM kinaasisignalointitiejärjestelmä on eräs dominoiva signalointijärejestelmä , joka osallistuu tuumoreitten metastoimiseen. Siitä löytyy paljon asiaa internetissä.

http://www.curehunter.com/public/pubmed15026997.do

"Tumoreitten metastoimisessa on olennaista, että syöpäsolu pystyy liikkumaan paikasta toiseen ja invasoitumaan kudoksiin. Tällaisissa metastaattisissa soluissa solujen kiinnittyminen on muuntunut (adheesio) ja niiden liikkuvuuskin, motiliteetti, on muuntunut, kun niitä tutkitaan koeputkissa kemotaktisuutta analysoimalla.

Tässä metastasoinnissa juuri on häiriintynyt Rho/ROCK/LIM kinaasi tie- avainasemassa, sillä se osallistuu normaalisti aktiini-sytoskeletonin säätelyyn.

Eräät tutkijat käyttivät ribozyymikirjastoa(Rz) ja valitsivat summassa erään ROCK-proteiiniin kohdistuvan ribozyymin. Ribozyymi tuota ROCK tekijää vastaan poisti metastaattiset ominaisuudet.

Sitten he halusivat määrittää LIM-kinaasi2- spesifisen ribozyymin vaikutuksen fibrosarkoomasolun metastaattisuuteen ja proliferoituvuuteen. He kohdistivat LIM-kinaasi 2-expressioon ribosyymejä(Rz). Tehokas Rz valikoitiin esiin expressioanalyysiin perustuen. Sitten soluja transfektoitiin Ribozyymillä joka oli spesifisesti tehokas LIMK-2 vastaan ja sitten tutkittiin metastaattiset ja proliferatiiviset ominaisuudet.

Tuloksenaan he sanoivat, että solufenotyyppien analyysit sellaisenaan kuten vaikutus soluproliferaatioon, solumigraatioon ja kolonisoitumisiin, viittaavat siihen , että LIMK-2 expression vaimenema ihmisen fibrosarkoomassa rajoitti solujen migraatiota ja tiiviitten kolonioitten muodostamiskykyä vaikuttamatta solun proliferaatiotahtiin tai elinkykyyn.
Johtopäätös: LIMK-2 spesifisen ribozyymin kohdistaminen tuumorin metastaattisia ja maligneja ominaisuuksia vastaan voi toimia tehokkaana terapiana invasiivisissa tuumoreissa haitan ollessa minimaalista ympäröivissä normaaleissa soluissa.