Isopreenirakenteista yleistä

Prenylaatio tai isoprenylaatio  tarkoittaa hiiliketjun muuttamista  solusynteeseissä siten, että lidipikaltaisuus lisääntyy,  "lipidoitumista".  Tällainen hiiliketju saa ankkuriominaisuuksia
ja peptidi, joka prenyloituu saa hankittua ankkurin itselleen, ja pystyy sijottumaan solukalvoon.
  Ihmisen kehossa suorittaa prenylaatiota  sellainen aineenvaihduntareitti kuin MEVALONIHAPPOTIE:Tämä tie tunnetaan lähinnä siitä, että sen lopusta syntyy myös KOLESTEROLI ja DOLIKOLI.
KOLESTEROLI ja DOLIKOLI ovat vastavaikuttajia ja
vastaavat solukalvojen fluiditeetista sen vedenpitävyyden lisäksi.
Mutta DOLIKOLI-fosfaatti on myös tärkeä, koska
sen varaan asettuu glykoproteiinien sokerirakenteita solukalvoon ( Glykocalyx).
Monta isoprenoidia ( joita keho ei pysty tekemään)  saadaan ravinnossa, kuten rasvaliukoisia vitamiineja.(AEK)

PRENYLAATIOISTA

LÄHDE: Michal Gerhard . Editor. Biochemical Pathways. An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology.

ISOPREENI

Tällä kertaa kirjoitan sellaisesta asiasta kuin prenylaatiosta tai oikeastaan isoprenylaatiosta.

Kehossa on sellaisia essentiellejä hiiliketjuyksikköjä, joissa on 5 hiiltä tietystä erityisessä rakenteessa. (ISOPREENI). Mutta kehon oma järjestelmä ei ole ihmiselle aivan niin riittävä kuin kasveille ja bakteereille, sillä ihminen tarvitsee osan ”prenyloituja” molekyylejä essentielleinä vitamiineina (A,E,K) ravinnon taholta. Myös valmista kolesteroliakin tarvitaan hieman ravinnossa, vaikka endogeeninenkin kolesterolitie toimii ja se tulee tästä prenylaatiotiestä skvaleenin kautta.

Prenylaatio tai isoprenylaatio tai ”lipidaatio” muuntaa hiiliketjua siten, että siihen liitetään hydrofobisia ryhmiä, jolloin saadaan kalvoliukoisuutta. Tämä ominaisuuson hyvä ankkuritoiminnoissa proteiineille, jotka sen takia mielellään antavat ”prenyloida” rakenteensa.

(Prenylation or isoprenylation or lipidation is the addition of hydrophobic molecules to eg. a protein)..

HMG-CoA merkitys. Mevalonaattitie tuottaa prenyloitumista

Ihmisen fundamentaalisimmasta aineenvaihdunnasta käsin voi syntetisoitua sellaista molekyyliä kuin mevalonihappo (MEVALONATE). Tämä aineenvaihdunnallinen tie tunnetaankin mevalonihappotienä. Sen tunnetuin päätuote on kolesteroli ( Cholesterol) ja koska kolesterolin aineenvaihdunnassa on nykymaailman aikaan paljon epätasapainoa, on ratkaisuna ollut kolesterolin alentaminen puuttumalla mevalonihappotiehen aivan sen varhaisvaiheissa.

1. AKTIVOITU-ETIKKAHAPPO, Acetyl-CoA sisältää aktivoidun 2 hiilen yksikön.(C2)
2. Aktivoitu asetoetikkahappo, ACETOACETYL-CoA sisältää kondensaattina kaksi etikkahappoa ja nyt hiilten määrä on 4.
3. Tähän liittyy vielä C2- yksikkönä yksi aktivoitu etikkahappo ja HMG-CoA syntaasi alkaa vaikuttaa. Vesimolekyyliäkin tarvitaan reaktioon.
4. Muodostuu kondensaaatti , jossa on kuusi hiiltä (C6): Sen nimi on Beeta- HYDROXY-beeta-METHYL GLUTARYL-CoA ja se on nyt kolmesta etikkahaposta vesimolekyylin avulla kondensoitunut molekyyli, jonka lyhennys on HMG-CoA. (C6) Kolesterolin muodostusta koetetaan tästä alkuvaiheesta jarruttaa ennen kuin tämä ehtii muuttua mevalonaatiksi. Mutta jos tätä molekyyliä HMG-CoA kertyisi liikaa, on mm rhabdomyolyysin tai lihaskipujen vaaraa ja jotkut kolesterolia-alentavat lääkkeet eivät olekaan onnistuneet lihaskudos ym vaikutusten takia.
5. Seuraava reaktio olisi HMG-CoA reduktaasi, jonka tuloksena tulee MEVALONAATTI-molekyyli. Esim statiinit koettavat jarruttaa reduktaasia, jotta mevalonaattia ei pääsisi niin paljon muodostumaan.
6. Tästä vaiheesta MEVALONAATTI-molekyyli voi tarvittaessa vielä pilkkoutua aktiiviksi etikkahapoksi takaisin ja liittyä kehon tärkeään aktiivin etikkahapon aitioon Acetyl-CoA ( muuttua sitten esim energiaksi tai siirtyä pitkien rasvahappojen synteesin puolelle) TAI ketoositilanteessa vain asetoetikkahapoksi, joka voi muuttua beeta-voihapoksi ( molemmat sellaisia puolipalaneita ketotuotteita). Maksa ei kuitenkaan tätä asetoetikkahappoa käytä, vaan se joutuu extrahepaattisiin kudoksiin, jotka ainoastaan voivat aktivoida siitä asetoasetyyli-CoA muotoa ja nyt se kelpaa taas pitkien rasvahappojen tai /ja kolesterolin synteesiin. Myös aktiivi meripihkahappo pystyy aktivoimaan asetoetikkahapon aktiiviksi asetyylietikkahapoksi takaisin. Täten on aika varmaa, että on hyvät lähtökohdat saada molekyylejä pitkien rasvahappojen synteesiin ja samalla välillä mevalonaattitiehen. Tämän tärkeän asetoetikkahapon hyödynnys on ihmisellä hyvä. Evolutionaalisesti ihmisen keho suosii rasvaenergian varastoimista joko neutraalirasvoina, jonne siirretään pitkiä rasvahappoja glyserolitumaan tai kolesterolin puolelle ja näihin erilaiisiin isoprenyaatiotuotteisiin - ne eivät olevarsinaisia  energia-aineita vaan funktionelleja. Koelterolikin pitää erittää pois kehosta.  Ne kuuluvat myös kehon luonnolliseen tärkeään puolustukseen, uloiseen ”nahkaan”, ihoon, solumembraniin, vedenpitävään puolustukseen.Myös luonnolliseen immuniteettiin. 
7. MEVALONAATTIA saadaan HMG-CoA molekyylistä, kun siitä poistuu Koentsyymi A. mikä on helppo reaktio. : www.med.unibs.it/~marchesi/cholest.html

MEVALONAATTI Molekyyli on tosi sopiva solukalvon lipidiankkuripohjan tekijäksi. 

8. Jos fosforyloitu mevalonaatti dekarboksyloituu C5- hiiliseksi, ollaan isopentenyylipyrofosfaatissa. (IPP) Nyt on saatu tärkeä perusmuoto IPP, josta voidaan saada luonnosas hyvin yleisiä  isoprenoidi -yksikköisiä rakenteita ( lego-tapaisesti) , kun niitä kondensoidaan keskenään eri mittaisiksi molekyyleiksi, joille löytyy taas omat odottavat entsyymityövälineistöt, kun tietty mitta on koossa.

Miksi isoprenoidirakenne on tärkeä?

Fosfolipidikaksoiskerroksessa on keskimmäinen kerros vedenpitävää kolesterolia, mutta jos se olisi pelkästään kolesterolia, se olisi aika tankea, mutta kolesteroli-puusta tulee muitakin rakenteita, jotka moduloivat kolesterolin steroidista tumaa ja vastavaikuttavat kolesterolin tankeuteen. DOLIKOLI on KOLESTEROLIN vastavaikuttaja kalvon pitämisessä fluiditeetilta sopivana. Lisäksi dolikoli kalvon keskivaiheilla muodostaa miljöötä, jonne vastaavan hahmoisia isopreenisivuketjuja asettuu, kun eri aineet ankkuroivat kalvoon

Tällä isoprenoidisella rakenteella voidaan molekyyleille tehdä sellaisia ankkureita, joitten avulla molekyylit pystyvät pysyttelemään kiinni solukalvossa eri pitkiä aikoja kuten vitamiinit. Sen takia monet vitamiinit omaavat pitkän isoprenoidisen sivuketjun, kuten E-vitamiini, kaikki K-vitamiinit, A-vitamiini, betakarotenoidit ja iso määrä kasvisflavonoideja ja antioksidantteja, ubikinonit. K1- fytyylisivuketju oksidoituu aika nopeasti, joten lyhyeksi muuntunut tähde metylnaftokinoni  onkin xenobioottinen, joka nopeasti poistuu kehosta. K1- vitamiinin varasto on yhtä suuri kuin päivä tarve. Menakinonit sensijaan pysyttelevät kauemman aikaa kehossa pitkine sivuketjuineen, kuten esim maksassa ja luustossa.

Menakinonin isoprenoidissa on kaksoisidoksia useampia. K1 vitamiinin sivuketjussa on 1 kaksoissidos. Mm aivoissa kuitenkin on entsyymeitä, jotka muuntavat K1 vitamiinia menakinoni-4 muotoon, joka on mieto K2-vitamiini, aivokudoksen suosima koko. 

Ubikinonin sivuketju syntetisoidaan kehossa , ihmiselläkin, ja kondensoidaan vaikuttavaan molekyyliin ubikinoniksi.

Kolesterolilla on paljon tehtäviä, joista yksi on sijaita fosfolipidikaksoiskerroksen sisällä. Jos nyt kolesteroliongelmien takia joudutaan manipuloimaan koko mevalonaattitietä ja isoprenoidiankkureitten saaminenkin (dolikoli-P) herättää kysymyksiä, voidaan asiaa korjata pitämällä huolta kasvisperäisistä antioksidanteista ja bioflavonoideista ravinnossa, jolloin isoprenyloituja molekyylejä saadaan kuitenkin riittävästi solukalvoihin. Täysin ei ravintoperäistä kolesterolilisääkään pitäisi eliminoida. Esim pari kananmunaa viikossa ainakin on aivan sopivaa. Eikä  "yksi  muna päivässä" liene liikaa.  Exogeeninen kolseteroli ilmeisesti negatiivisesti säätää endogeenisen kolesterolin tuotantoakin, sillä keho tarvitsee tietyn määrän kolesteroliaan joka päivä kaikkien  solujen ja kalvorakenteiden  ylläpitoon.

Mevalonaattitie näihin sivuketjuja antaviin ryhmiin on seuraava.

Tulee huomata että tämä on luonnossa yleinen molekyyli, mutta ihmisellä esiintyy vain vain muutamia isopreenirakenteita ja muutamia aineenvaihdunnallisia teitä. Ilman mevalonaattitietä ihminen ei pysty muodostamaan isopreeneja, kuten kasvit tai bakteerit taas puolestaan pystyvät.

Ihmisellä toimii tällainen sekvenssi tapahtumia.

MEVALONAATTI

ISOPENTENYYLI-PP (IPP)

GERANYYLI-PP (GPP)

FARNESYYLI-PP (FPP). Sivutiet: FARNESOLI (FOH), DOLIKOLI, UBIKINONISIVUKETJU, ANKKURIT

GERANYLGERANYYLI-PP (GPP): tiettyjen  mielellään prnyloituvien PROTEIINIEN ANKKURI

SKVALEENI

KOLESTEROLI ( Kolesterolista tulee sitten myös hormoneita, joilla on steroidirakenne)

ISOPREENI CH2=C(CH3)-CH=CH2

Tämä on tavallinen viiden hiilen rakenneyksikkö luonnossa. Kasvit ja eläimet käyttävät sen aktivoitua pyrofosfaattimuotoa
 ( IPP)

ISOPENTENYYLI-PP,     CH2 =C(CH3)-CH2-CH2-PP

Tässäkin on viisi hiiltä (5C). Bakteereissa ja vihreissä levissä ja kloroplasteissa tätä voi muodostua aivan ilman mevalonaattitietäkin ja silloin se muodostuu suoraan kondensoitumalla hydroksietyylitiamiini pyrofosfaatista ja glyseraldehydi 3-fosfaatista. Se aineenvaihdunnallinen tie, mitä silloin käytetään, menee D-1-xyluloosi 5-fosfaatin kautta Tuotetta bakteerit ja kasvit taas käyttävät isoprenoidiensa syntetisoimiseen. Mutta ihmisellä tarvitaan mevalonaattitietä.

LUONNON TERPEENIT MUODOSTUVAT NÄISTÄ ISOPRENOIDEISTA

Hyvin suuri ryhmä orgaanisia kasviyhdisteitä on rakenteeltaan terpeenejä, ja niitä jaetaan monoterpeeneihin (C10) , seskviterpeeneihin (C15) ja diterpeeneihin (C20) sen mukaan miten ne koostuvat.

Terpeenien biosynteesi tapahtuu intramolekulaarisella prenylaatiolla ja se alkaa geranyyli-PP molekyylistä käsin (GPP) tai farnesyyli-PP.stä (FPP) tai geranyyligeranyyli-PP.stä käsin Kun nyt sitten johdetaan jokin hydroksyyliryhmä (-OH) tai karboksiryhmä (C=O) molekyyleihin, syntyy suunnaton määrä erilaisia yhdisteitä Monet niistä ovat aromaattisia ja joillain on havaittu lääkkeellisiä ominaisuuksia, esim. antimalarialääkkeitä on niistä löytynyt.

MONOTERPEENEITÄ (C10) muodostuu geranyyli-PP: stä, neryyli-PP.stä ja linalyyli-PP:stä käsin. esim. geranioli, limoneeni, alfa-pineeni, kamferi, teresantoli. Näitä on vain evoluution korkeimmissa kasveissa ja ne ovat haihtuvia, ominaistuoksun omaavia, useimmiten niissä ei ole happea.

SESKVITERPEENEJÄ (C15) muodostuu farnesyyli-PP:stä, joskus nerolidyyli-PP:sta. Niitä ovat farnesoli, kurkumeeni (curcumene), cadineeni ja cedreeni. Näitä esiintyy sellaisilla lajeilla kuin tracheophyta, sammaleet, sienet, ruskeat ja punaiset levät, hyönteiset. Niitä on eteerisiä öljyjä, myös kasvien hormoneja kuten phytoalexiinit, hyttysten varhaismuotojen hormoneja.

DITERPEENIT (C20) muodostuvat geranyyligeranyylistä käsin. Niitä ovat fytoli, kauruunihappo, abietiinihappo. Niitä on kasveissa ja sienissä ( fungi). Nämä ovat osina resiineissä ja balsameissa. Usein ne ovat hyvin oksidoituneita. Gibberreliinihappo ( Gibberelic acid), jota muodostuu kaureenista (kaurene), on kasvien kasvuhormoni.

ALL-TRANS-METABOLIITIT

KAROTENOIDIT ( Carotenoids), (C40) ovat muodostuneet kahdesta geranyyligeranyylimolekyylistä.

Evolutionaalisesti korkeat kasvit, hiivat ja levät tuottavat cis-phytoeeniä (cis-phytoene), joka muuttuu trans-muotoon myöhemmin. Mutta bakteerit tekevät trans-fytoeeniä suoraan. Kalvoon kiinnittyneet fytoeeni-desaturaasit oksidoivat ja syklisoivat fytoeenejä useissa vaiheissa ja niistä tulee all-trans- ALFA-ja BEETA-KAROTEENEJA.

Asteittaisella oksidaatiolla kasvit ja bakteerit muuttavat niitä XANTOFYLLIINEIKSI, jotka toimivat valoa absorboivina fotosynteettisinä pigementteinä kasveilla. Ne pystyvät myös eliminoimaan vapaita radikaaleja ja toimimaan kalvoa suojaavina aineina ja siinä ne vastaavat ihmisten E-vitamiineja.

BEETA-KAROTEENI voi katalysoitua dioksygenaasilla ja pilkkoutua symmetrisesti all- trans RETINOLIKSI Tämä yhdiste on taas selkärankaisille - kuten ihmiselle- välttämätön näköprosessissa (visual process). Soluissa RETINAALI on tasapainossa all-trans RETINOLIN kanssa (A-VITAMIINI). Solujen välinen kuljetus ja jakautuminen edistyy spesifisten retinolia sitovien kompleksien avulla, kuten RBP, CRBP II, IRBP), kun taas varastoituminen ja otto ravinnosta tapahtuu retinoli-rasvahappoesterien muodossa. Toisaalta pieni määrä RETINAALIA oksidoituu RETINONIHAPOKSI ( Retinoic Acid). Tätä yhdistettä kuljetaan hyvin spesifisenä kompleksina solujen retinonihappoa sitovana proteiinina (CRABP, Cellular Retinoic Acid Binding Protein). Retinonihapolla on hormonin kaltaisia ominaisuuksia solujen kehityksessä ja solun jakaantumisessa, minkä se vaikuttaa tiettyjen tumareseptoreitten (NRs, Nuclear Receptors) kautta. Promyelosyyttisessä leukemiassa (PML) sitä annetaan cancerostaattisena lääkkeenä. BEETA-KAROTEENIT ovat tärkeitä myös immunologisen puolustuksen kehittymisessä ja arterioskleroosin estämisessä.

RETINOIDIEN katabolia tapahtuu konjugoitumalla glukuronihappoihin ja erittymällä virtsaaan.

POLY-Cis-METABOLIITIT: DOLIKOLI, TEIKOHAPPO ja LUONNNONKUMI

Ihmisessä  on DOLIKOLIA.

DOLIKOLI-P (C70----C120) on aivan essentielli molekyyli ihmisellä, sillä se toimii fosforyloituna ollessaan sokerirakenteitten kantajana animaalisessa kehossa solun pintakalvossa, kasveilla ja sienillä, kun muodostuu GLYKOPROTEIINEJA (gp) endoplasmisessa retikulumissa (ER). Edelleen dolikyyliesterit toimivat rasvahappojen kuljetuksissa ja varastoitumisissa.

Pyrofosforyloidusta Cis GGPP tiestä, sanoo Michal, (mutta moni muu lähde FPP-tiestä), lähtee kehittymään DOLIKOLI ja siinä välittää hyvin hanakkaasti toimiva entsyymi polyprenyyli-cis-transferaasi.

BAKTEEREILLA on LPS ja TEIKOHAPPO ( teichoic acid)

Bakteerit käyttävät undekaprenyyli-P (C55) muotoa glykopeptidiensä kuljettajana, kun ne muodostavat soluseinämänsä mureiinia ( MUREIN).

Se toimii myös sokerien kantajana muille bakteerikalvon komponenteille, kuten LIPOPOLYSAKKARIDEILLE (LPS) tai teikonihapoille (TEICHOIC ACIDS). Molemmat yhdisteet kantavat 2-3 kaksoissidosta, jotka sijaitsevat trans-konfiguraatiossa niiden non-hydroksyylisessä päässä.

LUONNON KUMI

Isopentenyyli-PP (IPP) on alkulähtökohta luonnon kumeille ( esim lähteestä Hevea brasiliensis)., jotka sisältävät hyvin pitkän all-cis isoprenoidi ketjun (C 3500---- C25000).

ISOPRENOIDI-SIVUKETJUT OVAT TÄRKEITÄ VITAMIINEISSA

Bakteerien pigmenteissä ja kasvihormoneissa, cytokiniineissä, on isoprenoidisivuketjuja.

FYTYYLI-PP (C20) muodostuu all-trans-geranyyligeranyyli-PP:stä kasveilla ja eräillä bakteereilla.

FYTYYLI toimii KLOROFYLLISSÄ sivuketjuna.

Se on myös alfa-TOKOFEROLIN eli E-VITAMIININ sivuketju.

K1- VITAMIINI eli FYLLOKINONI, käyttää FYTYYLI- sivuketjua myös.

Pitempiä isoprenoidisia sivuketjuja on läsnä K2-vitamiineissa, joita sanotaan MENAKINONEIKSI ( C20----C30).

Samoin UBIKINONIN sivuketju on pitkä C30---C50). Tätä valmistuu ihmisessä mevalonihappotiestä.

Bakteereitten hengityksessä on tärkeitä menakinonit ja/tai ubikinonit. Joillain bakteereilla on hyvin monen pituisia menakinoneja kuten stafylokokeilla, joilla kaiketi on bakteereista suurin kirjo menakinoneja. Bakteereita voi lajitella niitten menakinoni- ja ubikinoni tyyppien mukaan.

Kasvien hengityksessä tärkeä on PLASTOKINONI ja sen koko on C45.

MONET PROTEIINIT liittyvät solukalvoihin ISOPRENOIDI-ANKKUREILLA.

Tio-eetterisidoksella useimmiten liittyy proteiini farnesyliin, joskus myös geranyyligeranyyliketjuun.

ESIM. Ras proteiini, G gamma-proteiinit ja Heme-A ovat tällaisia proteiineja.

Tämä prenylaatio määrää proteiinin sijoittumisen ja funktion.

Proteiinigeranylgeranylaation tärkeys luonnollisessa immuunivasteessa (Thesis, Akula Murali)

Päivän väitöstilaisuus oli klo 13 -16 välillä. Sali oli miltei täynnä kuulijoita.

Thesis-kirjoja kuitenkin riitti, vaikka tulin aivan tasalta laitokselle.

Vastaväittäjänä toimi USA:sta Pohjois-Carolinan Yliopiston Lääketieteellisen instituutin Biokemian ja Biofysiikan professori Sharon Cambell. Koetan koota lyhyesti sen, mitä käsitin väitöksestä.

Professori Cambell antoi väitöksen aihepiiristä laajaa yleiskuvaa: 

Kyseessä oleva metabolinen tie on aktiivista etikkahaposta päin entsymaattisesti muodostuvien proteiinein ketju ja eräs päätetuote synteesiketjusta on kolesteroli ja sen johdannaiset, mm erilaiset hormonit. Koska liian korkeat kolesteroliarvot ja ja sydänverisuonitaudit ovat maailmassa suuri rasitus, juuri tähän sytnteesitiehen on kohdistettu muutamia lääkkeitä, kuten kolesterolia-alentavien lääkkeiden arsenaali. Näistä tunnetummat lääkkeet ja yleisimmin käytetyt ovat statiinit. Ottaen huomioon että sydäntauti kuolleisuus esim Ruotsissa on päivän METRO:n n mukaan 50 infarktia päivittäin, jouluisin 70,  statiinien ja muiden kolesterolin hallintaan tarkoitettujen lääkkeiden asema lääkelistoilla on ja pysyy vakaana.

 Lisäksi on havaittu että tämä mainittu metabolinen synteesitie osallistuu myös syövän syntyyn, Amerikkalainen professori valaisi asian tutkimisen tärkeyttä, sillä USA:ssa kuolee vuosittain syöpään 609 640 kansalaista,  mikä merkitsee kolmea jumbojetillistä ihmisiä päivittäin.

Verrattuna tilanteeseen, joka vallitsi 1977, on syövän diagnostiikka ja hoito kohentunut kovasti, joten 5 vuoden elossapysyvyys on selvästi parantunut, 20%.

 Mitä tulee syövän hoitoon, ne ovat perinteisesti kirurgiaa, sädehoitoa, kemoterapiaa, hormoneja, immunoterapiaa, täsmennettyä immunoterapiaa. Konvemtionellit syöpäterapiat  ja lääkkeet ovat sytotoksisia, ne ovat myrkkyjä, jotka eivät tee eroa terveen solun ja syöpäsolun välillä , mikä haitaa potilaiden selviytymistä. Sen takia on tärkeää tutkia keinoja, joilla voitaisiin löytää niin täsmällistä syöpäsolua tuhoavaa strategiaa, että normaalit solut eivät kärsisi, vaan oman kehon immuunivaste vahvistettuna voisi itse alkaa tuhota syöpäsoluja.  (Ollaanhan  immuno-onkologian aikakaudessa!)

Päivän väitösaiheen metabolinen tie johtaa mevalonihaposta käsin isopreenirakenteisiin kuten farnesyyliin ja geranylgeranyyliin. ( ennen kuin muodostuu skvaleeni ja kolesterolia).

Nämä proteiinirakenteet ovat tärkeitä sillä ne ovat hydrofobisia ja solukoneiston eräät proteiinit tarvitsevat rasvaliukoista liitettä posttranslationaalisesti päästäkseen pysymään solukalvossa ja pysymään aktiivina. 

Tirdetään eräs proteiinisuurperhe, ne ovat pieniä GTP-aaseja ja ne  tarvitsevat tällaista prenylaatiota: RAS-superperhe.

On havaittu, että 30%:ssa syövistä on tapahtunut RAS- geenin mutaatio, mikä tekee juuri tämän proteiiniryhmän syöpätutkimuksissa kiinnostavaksi. RAS- geeni oli sitäpaitsi ensimmäinen geeni, joka oli havaittu ihmisen onkogeeniksi. Tuumoriperäinen RAS koaktivoituu yhden ainoan aminohapon susbtituutiosta. RAS on onkogeeninen käynnistäjä. Yhtä syöpää kohden on todettu noin 80 mutaatioita, mutta useimmat niistä ovat harmittomia. On olemassa anti-RAS- lähestymistapa lääkekehittelyssä ja se on kliinisen kokeen vaiheessa. RAS - prosessoituminen on avainfunktio, johon kohdistetaan.

On olemassa jo farnesyylitransferaasi-inhibiittoreita (FTI). RAS onkogeeneja on kolme, esim. KRAS ja HRAS. Niistä HRAS on eniten FTI-sensitiivinen ja KRAS vähemmän sensitiivinen Geranylgeranyylitransferaasi1 ei modifioi HRAS-onkogeenia , mutta se pystyy modifioimaan KRAS-onkogeenia. Tämän takia on kiinnitetty nyt huomiota geranylgeranylaatioon  ( On  tutkittu  kaksoisprenylaatio-inhibiittoreiden mahdollisuutta). KRAS- onkogeenistä on tarkempi kuvaus väitökirjassa. 

Väitöskirja pureutuu yksityiskohtiin RAS-superperheen jäsenten prenylaatiotapahtumissa, sillä eri jäsenten prenylaatioden kesken on eriävyyksiä ja vuorovaikutuksia, joita on selvitettävä, jotta saadaan käsitystä siitä, miten ja mitä täsmä lääkettä pitää kombinoida ja mihin prosessikohtaan kohdentaa. Saattaa olla vielä tuntemattomia vaikuttajaentsyymeitäkin ja kofaktoriproteiineja.Tutkija oli seulonut 700 proteiineista mahdollisia vaikuttajia esiin. 

Statiinin merkitystä punnittiin.

Mikä vaikutus on kolesterolisynteesin estoon tarkoitetulla mevalonaattitien ylävirrassa tapahtuvalla prenylaatiotien statiinivaimennuksella näihin RAS-superperheen proteiinien keskinäisiin vuorovaikutuksiin, tasapainoon ja funktiokarttaan? Kun kolesteroli onnistutaan laskemaan, mitä tapahtuu prenylaatiokartalla? Mitä vaikutuksia havaitaan heijastuvan kehoon?)

Prenylaation merkitys näille pienille GTPaaseille on vaikutusajan pidentyminen. Kun ne saavat lipidiankkurinsa prenylaatiosta, ne pysyvät kauemman aikaa vaikuttamassa, aktiivina , ”ON”. . Jos prenylaatio blokeerattiin seurasi RAC1-effektoreitten interaktioita ja tulehduksellinen signalointi käynnistyi ja se oli haitallista.    Prenylaatiolla olitäten  merkitystä luonnollisen immuniteetin ärhäkkyyden suitsemisessa , sillä RAC1:n ollessa prenyloituneena sen interaktiot vaikuttajiin estyivät, kertoo väitöskirja.

 On uutista niveloireiden puolelta kuten synoviittia ja pahaa nivelreumaa. Statiinista tiedetään myosiittititapauksia. Tulee mieleen, että statiini saattaa olla sellainen ”haulikolla variksia” ampumista, josta sitten ”harhahaulit” aiheuttavat asioita, joita pitää kartoittaa myös. Mutta tämä prenylaatiopuolen kartoitus on vasta menossa, kun taas statiinien edut on ja nähty ja lääkekandidaatit voat kokeiluvaiheissa.Statiinine edut  taas jo  näkyvät nopeissa akuuteissa sairauksissa, mutta prenylaatiopuolen vikasäätö heijastuu onkologian  katalasti   näkymättömään alueeseen.

Uusi väitöskirjamäärittelee proteiiinin geranylgeranylaation tärkeyttä luonnollisessa immuniteetissa.

http://hdl.handle.net/2077/57427

Väitöskirjaan kuuluvat osatyöt:

Akula MK, Shi M, Jiang Z, Foster CE, Miao D, Li AS, Zhang X, Gavin RM, Forde SD, Germain G, Carpenter S, Rosadini CV, Gritsman K, Chae JJ, Hampton R, Silverman N, Gravallese EM, Kagan JC, Fitzgerald KA, Kastner DL, Golenbock DT, Bergo MO, and Wang D. Control of the innate immune response by the mevalonate pathway. Nature Immunology. 2016; 17: 922–929.
VISA ARTIKEL

Akula MK, Ibrahim MX, Khan OM, Kumar TI, Erlandsson MC, Karlsson C, Xu XF, Brisslert M, Brakebusch CH, Bokarewa M, Wang D, and Bergo MO. Protein prenylation restrains innate immunity by limiting RAC1 effector interactions. Manuscript.

Väitöskirjan abstrakti:  

RHO family proteins and other intracellular proteins are prenylated with a 20-carbon lipid—a product of the cholesterol synthesis pathway—by protein geranylgeranyltransferase type I (GGTase-I). Prenylation is widely believed to target proteins to membranes where they encounter effector molecules that stimulate GTP-binding and activation.

 However, my host group found that knockout of GGTase-I in mouse macrophages (Pggt1bΔ/Δ) actually increases GTP-loading of RHO proteins such as RAC1, RHOA, and CDC42, and also increases proinflammatory signaling and cytokine production, and induces severe rheumatoid arthritis.

 These results suggest that prenylation may inhibit rather than stimulate RHO protein function. The mechanisms underlying increased GTP-loading and exaggerated innate immune responses in the absence of GGTase-I are not known. During my PhD, I have addressed these issues in two independent but interconnected projects. 

In project 1, we found that there is an imbalance between inflammatory and anti-inflammatory cytokines produced by Pggt1bΔ/Δ macrophages. We also found that knockout of GGTase-I prevents the interaction between KRAS and PI3K catalytic subunit p110δ and that this reduces signalling through the PI3K-AKT-GSK3β pathway. 

Moreover, Pggt1bΔ/Δ macrophages exhibit increased caspase-1 activity that is directly responsible for the production of active interleukin IL-1β, and that this effect requires the MEFV (pyrin) inflammasome. Thus, we conclude that GGTase-I promotes an association between KRAS and p110δ and thereby controls major inflammatory pathways in macrophages. 

In project 2, we tested the importance of RHO proteins in the development of arthritis in Pggt1bΔ/Δ mice. We found that knockout of Rac1 (i.e., in Pggt1bΔ/ΔRac1Δ/+ mice), but not Rhoa and Cdc42, markedly reduced inflammatory cytokine production and arthritis in Pggt1bΔ/Δ mice. 

We also found that non-prenylated RAC1 bound more strongly to the RAS GTPase-activating-like protein 1 (IQGAP1) – which facilitated RAC1 GTP-loading and activation. Knockout of Iqgap1 in Pggt1bΔ/Δ mice abolished cellular phenotypes in vitro and inhibited arthritis in vivo.

 Thus, we conclude that blocking prenylation stimulates RAC1 effector interactions and activates wide-spread pro-inflammatory signaling. Thus, prenylation normally restrains innate immune responses by inhibiting RAC1 effector interactions.

Muistiin 14.12. 2018  Jatkoa tulee vielä väitöstilaisuudesta.

Kolesterolin kuljetus (NPC1) endoplasmiseen retikulumiin ja NLRP3-inflammasomin aktivoituminen

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6168277/

Trafficking of cholesterol to the ER is required for NLRP3 inflammasome activation.

Marianne de la Roche,^1,* Claire Hamilton,^1,* Rebecca Mortensen,¹ A. Arockia Jeyaprakash,² Sanjay Ghosh,³ and Paras K. Anand¹ 

 Suomennosta abstraktista:

Solulipidit määräävät kalvointegriteetin ja fluiditeetin ja lisääntyvässä määrin  niitä  tunnistetaan  immuunivasteeseen vaikuttavina seikkoina.  Solun koleterolintarpeet täyttyvät biosynteesin ja  soluunotto-ohjelman avulla. Eräässä hyvin  mutkikkaassa tiessä, johon osallistuu  lysosomaalinen kolesterolin kuljettaja NPC1, steroli jakauttuu epätasaisesti intrasellulaarisissa aitioissa. Tutkijat kohdistivat NPC1 -kolesterolinkuljettajaan tutkimuksia farmakologisin ja geneettisin lähestymistavoin ja he saivat selville, että  kolesterolin kuljetuksen   blokeeraaminen myöhäisen endosomin (LE)--lysosomin kuljetustiessä  heikensi  NLRP3-inflammasomin aktivaatiota. 

 (NLRP3 on NOD -kaltaisia reseptoreita NLR , jolla on PYD, NACHT ja  LRR (leusiinitoisto) domeenit). 

Muuntunut kolesterolin lokalisoituminen plasmakalvossa  NPC1(-/-)  mallissa  poisti (kumosi)  TLR4- reseptorin  AKT/mTOR-signaloinnin.

Kuitenkin NLRP3-inflammasomin aktivoitumisen vajaakykyisyys johtui häriintyneestä  kolesterolin kuljetuksesta endoplasmiseen retikulumiin (ER)  ( eikä siis plasmakalvoon). 

Sen mukaan statiinin vaikuttama  akuutti kolesterolin vähenemä ER- kalvoista kumosi  caspaasi-1- aktiivisuuden  ja Il-1Beta-sekretion sekä   irrotti  NLRP3 -inflammasomin koostumuksestaan. 

Päinvastoin AIM2-inflammasomi suoritti koostumisen ja aktivaation progression ilman rajoitusta. 

Yhteenvetona  tutkimus selvittää Endoplasmisen retikulumin (ER) sterolipitoisuudet  metaboliseksi reostaatiksi  NLRP3-inflammasomin aktivaatiossa.

• Abstract. Cellular lipids determine membrane integrity and fluidity and are being increasingly recognized to influence immune responses. Cellular cholesterol requirements are fulfilled through biosynthesis and uptake programs. In an intricate pathway involving the lysosomal cholesterol transporter NPC1, the sterol gets unequally distributed across intracellular compartments. By using pharmacological and genetic approaches targeting NPC1, we reveal that blockade of cholesterol trafficking through the late endosome–lysosome pathway blunts NLRP3 inflammasome activation.

•  Altered cholesterol localization at the plasma membrane (PM) in Npc1^−/− cells abrogated AKT–mTOR signaling by TLR4. However, the inability to activate the NLRP3 inflammasome was traced to perturbed cholesterol trafficking to the ER but not the PM. Accordingly, acute cholesterol depletion in the ER membranes by statins abrogated casp-1 activation and IL-1β secretion and ablated NLRP3 inflammasome assembly. By contrast, assembly and activation of the AIM2 inflammasome progressed unrestricted. Together, this study reveals ER sterol levels as a metabolic rheostat for the activation of the NLRP3 inflammasome.

Introduction

The inflammasome is a multiprotein complex that plays critical roles in infectious, inflammatory, and autoimmune diseases. The NLRP3 inflammasome is the most characterized inflammasome in terms of the diverse stimuli that are known to activate it. Activation of the NLRP3 inflammasome requires assembly of NLRP3 and caspase-1 (casp-1) bridged together through the adaptor protein ASC, wherein casp-1 undergoes autoproteolytic processing. Subsequently, active casp-1 cleaves precursor forms of cytokines interleukin (IL)–1β and IL-18, which can then be secreted (Man and Kanneganti, 2015; Hamilton et al., 2017). Casp-1 also cleaves gasdermin D (GSDMD), making its N-terminal pore-forming domain active, leading to cell rupture (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). Distinct exogenous, endogenous, and environmental stimuli are known to activate the NLRP3 inflammasome, implying that these stimuli do not bind NLRP3 directly but likely converge on shared upstream pathways. The mechanistic details of NLRP3 activation remain ambiguous.

 Lipids are known to carry out diverse functions within cells, including being a major component of cell membranes, and as signaling messengers. Cholesterol is an essential lipid in mammalian cell membranes aiding varied functions, the most fundamental of which are membrane integrity and fluidity (Maxfield and Tabas, 2005). Levels of cholesterol in the cell are maintained through de novo synthesis in the ER, and uptake of low-density lipoproteins (LDLs) derived from dietary cholesterol. Excess free cholesterol can be toxic to cells; thus, sterol homeostasis needs to be integrated by a combination of cholesterol uptake, biosynthesis, and efflux programs. At the subcellular level, cholesterol follows an intricate pathway in cells (Ikonen, 2008). Exogenously obtained LDL bound to LDL receptor is internalized at the plasma membrane (PM) and is transported through the endocytic pathway to the late endosomes–lysosomes, where cholesterol esters within the LDL core are hydrolyzed by acid lipases. Unesterified or free cholesterol translocates through the lysosomal cholesterol transporter Niemann-Pick C1 (NPC1) to other cellular sites such as the PM and the ER. In the ER, cholesterol can be reesterified, permitting cytoplasmic storage in the form of lipid droplets.

Until recently, cholesterol has mostly been accepted to have an influence on immunity during pathological conditions such as in atherosclerosis (Fessler, 2016). However, evidence suggests that homeostatic lipid metabolism and trafficking directly regulate the inflammatory pathways in macrophages. For example, defective lipid trafficking in the absence of NPC1 leads to the lysosomal storage disorder Niemann-Pick disease (Platt et al., 2012). Mutations in the cholesterol efflux transporter, ABCA1, give rise to signs and symptoms of Tangier disease (Fasano et al., 2012). Similarly, perturbations in lipid metabolism contribute to several human pathologies including cardiovascular, obesity, and neurodegenerative diseases (Maxfield and Tabas, 2005). In addition to contributing to the pathogenesis of several diseases, cholesterol is also exploited by pathogens for their entry and proliferation within host cells. Several pathogens that lack the capacity for de novo sterol synthesis use cholesterol for their survival and replication by either increasing host lipid biosynthesis or redirecting cholesterol transport pathways (Coppens et al., 2000; Lauer et al., 2000; Carabeo et al., 2003; Kaul et al., 2004; Ilnytska et al., 2013). These studies suggest that reducing lipid synthesis may serve to limit nutrients available to pathogens, thus benefitting host cells. Conversely, host cells need lipids for mounting a robust immune response to infection through conserved pattern recognition receptors (Castrillo et al., 2003; York et al., 2015). Together, these studies lead to the hypothesis that lipid homeostasis is critical for an effective inflammatory response with implications for homeostatic lipid trafficking in both infectious and inflammatory diseases. Whether perturbations in homeostatic cholesterol trafficking pathway impact inflammasome activation remains unknown.

 In this study, by using pharmacological and genetic tools, we demonstrate that selective perturbation of the cellular cholesterol trafficking in macrophages ablates inflammasome activation. Mechanistically, perturbed sterol trafficking in Npc1 deficiency leads to two distinct effects: altered PM cholesterol levels resulted in inhibition of the AKT–mTOR pathway, while reduced cholesterol trafficking to the ER blunted NLRP3 inflammasome assembly. Accordingly, acute cholesterol depletion in the ER by statins decreased IL-1β secretion, which could be restored by supplementing with exogenous cholesterol. Our findings thus implicate sterol synthesis and distribution as critical factors influencing the activation of the inflammasome, thereby coupling lipid homeostasis to innate immune signaling.

---

Activation of inflammasome is characterized by cell swelling and subsequent osmotic lysis in the form of pyroptotic cell death following GSDMD cleavage (Kayagaki et al., 2015; Shi et al., 2015). In control cells primed with either LPS or Pam3, stimulation with ATP caused pyroptotic cell death. However, upon exposure to U18666a, cell death, and thus the secreted levels of cytosol-localized cell death marker, lactate dehydrogenase (LDH), were markedly diminished (Fig. 1, G–I). Overall these results demonstrate reduced casp-1 activation, IL-1β and IL-18 secretion, and decreased pyroptosis when cellular cholesterol trafficking is inhibited.

 ...

 We next performed experiments to determine the role of priming in our assays.  

Activation of the NLRP3 inflammasome requires two signals. 

(1) The first signal, which potentiates the NLRP3 inflammasome, is provided upon Toll-like receptor (TLR) ligation and results in the synthesis of pro–IL-1β and up-regulation of NLRP3 expression (Anand et al., 2011a). This first signal (also known as the priming step) is dependent on the transcription factor NF-κB (Bauernfeind et al., 2009; Hornung and Latz, 2010).

(2)  The second signal, which is more robustly provided by purinergic receptor P2X₇ agonist ATP, results in the assembly of NLRP3, casp-1, and adaptor protein ASC to form a multiprotein complex (Pelegrin and Surprenant, 2006).

...

 A diverse array of signals is known to activate the NLRP3 inflammasome. 

In contrast, ligands that activate the NLRC4 and AIM2 inflammasomes are well defined. 

The NLRC4 inflammasome is triggered by the recognition of cytosolic flagellin and components of the bacterial secretion system by upstream NAIP family members (Amer et al., 2006; Kofoed and Vance, 2011; Zhao et al., 2011).

 AIM2 inflammasome, in contrast, is activated by recognition of double-stranded DNA of ∼80 bp in length (Jin et al., 2012).

Cholesterol supplementation restores inflammasome activation

Variation in the levels of cholesterol and other lipids within the cell are sensed by master transcriptional regulators SREBP1 and SREBP2, which, respectively regulate fatty acid and cholesterol biosynthesis (Horton et al., 2002). A feedback mechanism tightly regulates cholesterol de novo biosynthesis to maintain homeostatic levels. Cholesterol depletion triggers ER resident sterol cargo protein SCAP to escort SREBP2 to the Golgi, where the precursor is cleaved to activate cholesterogenic genes. By contrast, in cholesterol-replete cells, conformational change in SCAP promotes insulin-induced gene–mediated retention of SREBP2 in the ER.

Picture:

---

F) Homeostatic cellular cholesterol trafficking to the ER is required for optimal inflammasome activation. Exogenously obtained LDL bound to LDL-R is endocytosed at the PM. Cholesterol efflux from the late endosome–lysosome compartment to other cellular sites such as the PM and the ER is dependent on NPC1. (G) Blockade of the cholesterol transporter NPC1 leads to lysosomal cholesterol accumulation and a subsequent decrease in cholesterol pool in both the ER and the PM. This in turn leads to decreased phosphorylation of AKT and mTOR following TLR ligation, causing a reduction in SREBP2-dependent lipogenesis. Additionally, perturbation in the ER cholesterol levels leads to decreased association of NLRP3 and ASC, resulting in reduced active casp-1 levels and IL-1β secretion. Furthermore, inhibition of ER cholesterol levels by statins similarly blunts NLRP3 inflammasome activation. LDL-R, low-density lipoprotein receptor; mTOR, mammalian target of rapamycin; SREBP2, sterol regulatory element binding protein 2.

RNF45 (GP78) ja RNF145 molemmat E3 ubikitiiniligaasit johtavat HMGCoA reduktaasia ERAD:iin.

RNF 45 (GP78)   oli  aiemmin jo todettu  ubikitiiniligaasiksi,  joka ubikitinoi ja johti silppuriin HMG-CoA-reduktaasin  steroli-induktiosta. Tutkijat etsivät muita ubikitiiniligaaseja,  jotka suorittavat  samaa ja havaitsivat RNF145, josta on vähemmän artikkeleita saatavilla.

 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29374057 
To identify other ubiquitin ligase(s) that may function together with gp78 in triggering HMGCR degradation,

J Biol Chem. 2018 Mar 16;293(11):4047-4055. doi: 10.1074/jbc.RA117.001260. Epub 2018 Jan 26. Ring finger protein 145 (RNF145) is a ubiquitin ligase for sterol-induced degradation of HMG-CoA reductase. Jiang LY¹, Jiang W¹, Tian N¹, Xiong YN¹, Liu J¹, Wei J¹, Wu KY¹, Luo J¹, Shi XJ², Song BL³.

Abstract

Cholesterol biosynthesis is tightly regulated in the cell. For example, high sterol concentrations can stimulate degradation of the rate-limiting cholesterol biosynthetic enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase, HMGCR). HMGCR is broken down by the endoplasmic reticulum membrane-associated (ERAD) protein complexes consisting of insulin-induced genes (Insigs) and the E3 ubiquitin ligase gp78. Here we found that HMGCR degradation is partially blunted in Chinese hamster ovary (CHO) cells lacking gp78 (gp78-KO). To identify other ubiquitin ligase(s) that may function together with gp78 in triggering HMGCR degradation, we performed a small-scale short hairpin RNA-based screening targeting endoplasmic reticulum-localized E3s. We found that knockdown of both ring finger protein 145 (Rnf145) and gp78 (Rnf45)  genes abrogates sterol-induced degradation of HMGCR in CHO cells. We also observed that RNF145 interacts with Insig-1 and -2 proteins and ubiquitinates HMGCR. Moreover, the tetrapeptide sequence YLYF in the sterol-sensing domain and the Cys-537 residue in the RING finger domain were essential for RNF145 binding to Insigs and RNF145 E3 activity, respectively. Of note, amino acid substitutions in the YLYF or of Cys-537 completely abolished RNF145-mediated HMGCR degradation. In summary, our study reveals that RNF145, along with gp78 (RNF45) , promotes HMGCR degradation in response to elevated sterol levels and identifies residues essential for RNF145 function.

Luonnollinen kolesterolituotteiden vaikuttama feedback säätelee kolesterolisynteesi linjaa

Kehon omasta kolesterolin muodostustien feedback mekanismista, josa tuoteet, sterolit vaiuttavat HMGCoA reduktaasin joutumista ERAD-hajoitukseen. Tämä säätely toimii luonnon eläimillä.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276505015273#fig6

Volume 19, Issue 6, 16 September 2005, Pages 829-840

Article

Gp78, a Membrane-Anchored Ubiquitin Ligase, Associates with Insig-1 and Couples Sterol-Regulated Ubiquitination to Degradation of HMG CoA Reductase

Author links open overlay panel
Bao-LiangSongNavdarSeverRussell A.DeBose-Boyd

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.08.009Get rights and content

Summary

Sterol-regulated ubiquitination is an obligatory step in ER-associated degradation (ERAD) of HMG CoA reductase, a rate-limiting enzyme in cholesterol synthesis. Accelerated degradation of reductase, one of several strategies animal cells use to limit production of cholesterol, requires sterol-induced binding of the enzyme to ER membrane proteins called Insigs.
Once formed, the reductase-Insig complex is recognized by a putative membrane-associated ubiquitin ligase (E3) that mediates the reductase ubiquitination reaction. Here, we show that gp78, a membrane bound E3, binds to Insig-1 and is required for sterol-regulated ubiquitination of reductase. In addition, gp78 couples regulated ubiquitination to degradation of reductase by binding to VCP, an ATPase that plays a key role in recognition and degradation of ERAD substrates. The current results identify gp78 as the E3 that initiates sterol-accelerated degradation of reductase, and Insig-1 as a bridge between gp78/VCP and the reductase substrate.

Introduction

An effective strategy in lowering plasma low-density lipoprotein cholesterol, a major risk factor in development of coronary artery disease, is to block reduction of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG CoA) to mevalonate (Illingworth and Tobert, 2001). This rate-limiting reaction in cholesterol synthesis is catalyzed by the enzyme HMG CoA reductase, the inhibition of which triggers regulatory responses that lead to a decrease in the concentration of blood cholesterol (Goldstein and Brown, 1990). Aggressive cholesterol-lowering therapies using competitive reductase inhibitors called statins reduce the incidence of heart attacks and prolong lives of patients with preexisting coronary artery disease (Heart Protection Study Collaborative Group, 2002, Scandinavian Simvastatin Study Group, 1994). However, the action of statins blocks production of mevalonate-derived regulatory products that normally govern the levels and activity of reductase through a multivalent feedback mechanism (Brown and Goldstein, 1980). In livers of animals and in cultured cells, the absence of these regulatory molecules leads to a major increase in the amount of active reductase protein, invoking the need for higher doses of statins to maintain their cholesterol-lowering effects (Kita et al., 1980, Brown et al., 1978, Lee et al., 2005). Thus, understanding how disruption of mevalonate metabolism leads to a compensatory increase in reductase could prove useful toward developing novel agents that block the increase and could thereby improve the effectiveness of statins.

HMG CoA reductase is anchored to membranes of the endoplasmic reticulum (ER) through its hydrophobic NH₂-terminal domain, which consists of eight membrane-spanning regions separated by short loops (Roitelman et al., 1992). The membrane domain of reductase precedes a large COOH-terminal domain that projects into the cytosol and exerts all of the catalytic activity of the enzyme (Gil et al., 1985, Liscum et al., 1985).

Part of the underlying mechanism for feedback inhibition of reductase involves its sterol-accelerated degradation, an action achieved through sterol-induced binding of reductase to one of a pair of ER membrane proteins called Insig-1 and Insig-2 (Sever et al., 2003a). Formation of the reductase-Insig complex is mediated by the reductase membrane domain and results in the ubiquitination of the enzyme, an obligate reaction for recognition and degradation of reductase by 26S proteasomes.

The mechanism for sterol-regulated ubiquitination of reductase was examined in a permeabilized cell system (Song and DeBose-Boyd, 2004). After permeabilization of cells, nearly all cytosolic proteins were released into the supernatant upon centrifugation, while membrane proteins such as reductase remained associated with the pellet fraction. This pellet fraction fully supported Insig-dependent ubiquitination of reductase stimulated by the in vitro addition of sterols and rat liver cytosol. Expanding on this observation, we recently reconstituted ubiquitination of reductase by simply incubating sterol-depleted membranes with sterols and purified ubiquitin-activating enzyme (E1) in vitro (Song et al., 2005). These results indicate that reductase ubiquitination must be mediated by membrane-associated ubiquitin-conjugating (E2) and -ligating (E3) enzymes.

In the current study, we utilized affinity purification, coupled with tandem mass spectrometry, to identify membrane proteins that associate with the reductase-Insig-1 complex. Through this approach, we identified gp78, a membrane bound E3, as an Insig-1-associated protein. Insig-1 binds to the membrane domain of gp78 in the absence or presence of sterols, and upon the addition of sterols, reductase is recruited to the complex.

Knockdown of gp78 by RNA interference (RNAi) prevents sterol-dependent ubiquitination and degradation of endogenous reductase.

Valosin-containing protein (VCP), an ATPase that participates in postubiquitination steps of ERAD, indirectly associates with Insig-1 by directly binding gp78 and is required for reductase degradation.

The current results identify gp78 as the ubiquitin ligase that initiates sterol-dependent degradation of reductase, and Insig-1 as a bridge between gp78/VCP and the reductase substrate.

https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1097276505015273-gr6.jpg
 

Kolesteroli

6.2.2018,10:56.Sana psalmista 86:15,16.

(A Maskil of Ethan the Ezrahite) Blessed are the people who know the festal shout, who walk , o Lord, in the light of thy countenance; who exult in thy name all the day, and extol thy righteousness.