Isoprenylaation tärkeys. GAP vaje ja RAS hyperaktivaatio, KRAS onkogeeni

Nyhet: 2011-05-11

Anna‐Karin Sjögren är årets mottagare av Assar Gabrielssons Pris. Hon får priset för sin avhandling som ger ökad kunskap om hur olika cancerformer utvecklas och upptäckt av möjliga måltavlor för cancerbehandling.
Assar Gabrielssons fond delar varje år ut priset för utmärkt avhandling i cancerforskning . Titeln på Anna-Karin Sjögrens avhandling är: “The Importance of Isoprenylation and Nf1 Deficiency in K‐RAS‐induced Cancer”. Fondens motivering till priset är: ”Avhandlingen håller hög vetenskaplig kvalitet i ett internationellt perspektiv med betydande relevans för framtida cancerbehandling”.


Perjantai 20. marraskuuta 2009 silmäilin uutta väitöskirjaa:

Löysin kirjastosta 2009  uuden väitöskirjan isoprenylaation tärkeydestä.
Siinä kerrottiin myös onkogenin K-RAS indusoimasta syövästä ja GAPs( inhibiittorin) Nft-vajeesta.

LÄHDE:
Sjögren Anna-Karin. The importance of isoprenylation and  Nf1 Deficiency in K-Ras-induced Cancer.
ISBN 978-91-628-7915-0 Göteborg 2009.

ABSTRAKTIN suomennosta:
RAS ja RHO proteiiniperheet ottavat osaa tuumorien muodostumisiin ja metastasoitumisiin ja ne kuuluvat ns. CAAX-proteiineihin. Näiden CAAX-proteiinien kohdistuminen solukalvoon ja niiden kunnollinen funktio riippuu posttranslatorisesta isoprenylaatiosta FTaasi- tai GGTaasi-1 entsyymeillä

FTaasi= farnesyylitransferaasi.
GGTaasi -1 = geranyl-geranyyli-transferaasi-1.

On kehitetty FTaasi-estäjiä (FTI) , inhibiittoreita (ja GGTRaasi-1 inhibiittoreita tarkoituksella blokeerata RAS-tekijöitten indusoiman syövän muodostus, mutta niiden hyödyllisyys on vaikea arvioida, koska kohdevaikutukset puuttuvat: lääkeresistenssi ja toksisuus.
Tämän työn yksi tarkoitus oli käyttää geneettisiä strategioita koe-eläimessä ja määrittää CAAX-proteiinin isoprenylaation fysiologinen tärkeys ja arvioida FTaasi ja GGTaasi-1 entsyymit mahdollisina anti-syöpälääkkeen kohteena.

Onkogeeninen mutaatio RAS:issa on tavallista syövässä ja johtaa RAS-signaloinnin hyperaktiivisuuteen.
Kuitenkaan RAS-mutaatio yksinään ei riitä ihmisen syövän kehittymiseen. Pikemminkin syöpä saa alkunsa useitten mutaatiotapahtumien keskeisten ko-operaatioitten seuraamuksena.

Eräs RAS-inaktivaattoriproteiini on NF1, tuumorisuppressorigeeni neurofibromatoosi tyyppi 1. Niinpä NF1 puute myös johtaa hyperaktiiviseen RAS-signalointiin, mitä muutamissa syöpätyypeissä esiintyy.

Mutta NF1 voi olla muissakin teissä operoimassa. Ei olla selvillä siitä, jos NF1 vaje on epäolennainen , tarpeeton, RAS-indusoidussa syövän kehittymisessä tai jos kaksi mutaatiota ko-operoi. Väitöstyön toinen tarkoitus oli määrittää NF1-vajeen merkitys K-RAS-indusoidun syövän kehittymisessä hiirillä.

Työssä käytettiin geenikohdennustekniikkaa hiirissä, jolloin samanaikaisesti aktivoitiin onkogeeninen K-RAS alleeli, jolloin indusoitui keuhkosyöpää tai myeloista leukemiaa,
ja inaktivoitiin entsyymejä FTaasia ja GGTaasia-1 koodaavat geenit.

Kun inaktivoitiin se geeni, joka koodasi entsyymin GGTaasi-1 beeta-alayksikköä, eliminoitui entsyymiaktiivisuus, proliferoituminen blokeerautui ja motiliteetti väheni fibroblasteista.
Edelleen tämän entsyymin GGTaasi-1 inaktivaatio vähensi tuumorin muodostumista ja lisäsi hiirten elossapysymistä K-RAS-indusoimassa keuhkosyövässä.
Lopuksi havaittiin, että useat solutyypit, myös keuhkon tuumorisolut ja makrofagit jäivät elinkykyisiksi GGTaasi-1 entsyymin puutteessa.

Sitten kun inaktivoitiin FTaasi entsyymin beeta-alayksikköä koodaava geeni, eliminoitui farnesylaatio HDJ2 ja H-RAS proteiineista, H-RAS-proteiinin  kohdistuminen plasmakalvoon estyi ja fibroblastien proliferoituminen blokeerautui.
FTaasin inaktivaatio vähensi tuumorin muodostumista ja lisäsi hiirien elossapysymistä K-RAS-indusoiduissa syövissä samaan määrään asti kuin GGTaasi-1 inaktivoitumisessakin.

Kun samanaikaisesti inaktivoitiin sekä FTaasi että GGTaasi-1, väheni keuhkotuumorit huomattavasti ja elossapysyminen parani.

Näistä tiedoista voidaan päätellä, että FTaasin ja GGTaasi-1:n estäminen voisi olla hyödyllistä K-RAS indusoitujen syöpien hoidossa.

Hiirissä seuraa myeloproliferatiivisia häiriöitä (MPD), jos ilmenee onkogeenistä  K-RAS proteiinia  tai jos  Nf1 inaktivoituu hematopoieettisissa soluissa. Nämä MPD:t eivät progredioidu akuutiksi myeloiseksi leukemiaksi (AML). Mutta jos samaan aikaan inaktivoituu Nf1 ja aktivoituu onkogeeninen K-RAS hematopoieettisissa soluissa, indusoituu hiirissä AML, akuutti myeloinen leukemia. AML-hiirissä ei ollut aktiivin RAS-proteiinin  pitoisuudet lisääntyneet, joten tästä heräsi ajatus mahdollisesta Nf1-puutteesta, joka voisi osaltaan vaikuttaa akuuttia myeloista leukemiaa non-RAS- teitse.

Tämä tulos viittaa vahvaan ko-operaatioon Nf1-puutteen ja onkogeenin K-RAS kesken ja tuo uutta valoa RAS-indusoidun leukemian kehittymisen mekanismiin.

....

VÄITÖSKIRJAN TAUSTATEKSTISSÄ kuvattiin normaalia isoprenylaatiota, sen entsyymejä ja aineenvaihdunnallisia ratoja.

• ISOPRENOIDIEN SYNTEESITIE (kertausta)

Tämä tie kuuluu osana kolesterolin synteesikarttaan, missä lähtöaine on aktivoitu etikkahappo (AcetylCoA), josta ensin tulee mevalonaattia. Tässä vaiheessa estäjälääke on statiini nimeltään.

Mutta mevalonaatista eteenpäin vaikuttaa farnesyyli difosfaatti syntaasi (FPP-syntaasi), joka samalla dekarboksyloi, kun muodostuu isopentenyyli-PP (IPP)(5C)
Samalla entsyymillä edelleen muodostuu geranyyli-PP (10C).
Molekyyli kasvaa edelleen farnesyyli-PP:ksi (15C) , FPP.

Tästä eteenpäin voi muodostua skvaleenisyntetaasilla skvaleenia, jossa on 30C tai geranyyligeranyylidifosfataasisyntetaasilla muostostuu  GG-PP (20C).

Skvaleenitie jatkaa kohti kolesterolin muodostamista.
Kolesterolia on kaikissa solukalvoissa rakenneosana ja sen on tärkeä normaaliainen.

Mutta keho käyttää FPP ja GG-PP molekyylejä tekemään eräisiin proteiineihin isoprenylaatioita, posttranslationaalista rakenteellista modifikaatiota.
Isoprenylaatiolla proteiinit saavat itselleen kuljetuksen solukalvoon tai solunsisäisiin rakennelmiin, siis tarkan osoitteen ja hyvän sijainnin, jolloin ne ovat  erilasiten  signaalien ja vaikutusten ulottuvilla.  

• ISOPRENYLAATIOTA VAATIVAT PROTEIINIT

Eräät ns. CAAX-proteiinit vaativat tällaisen posttranslationaalisen käsittelyn, jossa tapahtuu isoprenylaatio C (cysteiini) molekyyliin, sitten endoproteolyysi, jossa aminohapot -AAX pilkotaan irti, ja sitten taaphtuu  metylaatio, jossa CH3- metyyli liitetään cysteiiniin.

Osa CAAX-proteiineista ottaa isoprenyylirakenteeksi farnesyylin ja osa ottaa geranylgeranyylin riippuen X aminohaposta.
Farnesyyliliitos tapahtuu, jos X = seriini, metioniini tai glutamaatti.
Geranylgeranyyliliitos tapahtuu , jos X = leusiini tai fenylalaniini.

Nämä kolme posttranslationaalista modifikaatiota muuttavat molekyylin hydrofobiseksi ja niin se saa "osoitelapun", kuljetuksen subsellulaarisiin kohteisiinsa.
Isoprenylaatioota tekevät   FT  (FTaasi) ja  GGTaasi-1- entsyymit.
Endoproteolyysin tekee RCE1, (RAS converting enzyme, RAS. proteiinia muuntava entsyymi) .
Metylaation tekee ICMT, isoprenyl-cysteine –carboxyl-methyltransferase.

Siis isoprenylaatiossa kovalentti F ( farnesyl) tai GG ( geranylgeranyl) isopreenilipidi liittyy CAAX proteiinin cysteiinitähteeseen (C_)

FNTA on se geeni, joka koodaa FTaasi-entsyymin ja GGTaasi-1 entsyymin alfa-alayksikköä.
FNTB koodaa FTaasi-entsyymin beeta –alayksikköä .
PGGT1B on geeni, joka koodaa GGTaasi-1 entsyymin beeta-alayksikköä.
FNTB ja PGGT1B ovat  vain 25%:lta identtisiä keskenään.
Beeta-alayksikkö määrää substraattispesifisyyden.
FTaasi ja GGTaasi ovat sinkkimetalloentsyymeitä (Zn++). FTaasi tarvitsee lisäksi  ( magnesiumia Mg++)jotta katalyyttinen tehtävä onnistuu täydellä aktiivisuudella.

• CAAX on proteiinin tunnistusmotiivi:

FTaasi tunnistaa siinä X aminohappoja alaniini(A) , glutamiini(Q), seriini (S), metioniini  (M) tai fenylalaniini (F).
GGTaasi tunnistaa useimmiten leusiinia (L), myös fenylalaniinia (F) ja joskus metioniinia (M).

FTaasin selektiiviset proteiinisubstraatit ovat: RAS, tuman laminiini, transduciiningamma-alayksikkö, rhodopsiinikinaasi, centromeeriproteiinit.

GGTaasin selektiiviset substraatit ovat: RHOA, RHOC, RAC, RAP, heterotrimeeri G-proteiini gamma alayksikkö.

• On olemassa kolme RAS-onkogeeniä. H-RAS, , N-RAS ja K-RAS.

H-RAS varsinkin vaatii farnesylaation. Jos on farnesylaation inhibitio (FTI), tapahtuu solusyklin jarruttumsita. Tällä on tehoa joissain tuumoreissa. Mutatoitunut RAS-aktivaatio osaltaan vaikuttaa tuumoreita, progredioimista ja metastaaseja.

• NORMAALISOLUSSA ON HYVIN TIUKKA RAS-SIGNALOINTI.

RAS toimii molekulaarisena vaihteena, joka muuttaa solun ulkoisen ( extrasellulaarisen) signaalin solun vasteeksi. Signaali voi olla esim kasvutekijä, ja vaste on tällöin solun kasvua. Signaali voi olla myös sytokiinejä. Soluvasteet ovat proliferaatiota, differentiaatiota ja solun elossapsymistä.
Kun signaali on otettu vastaan, adaptoriteitse ( GRB2, SHC), rekrytoituu GEFs, jotka stimuloivat nukleotidimuutoksen RAS-proteiinissa, joka aktivoituu ja GTP-RAS-määrä lisääntyy.
Mutta on myös inhibiittoreita GAP ( ainakin kuusi erilaista), jotka heti inaktivoivat RAS-proteiinia stimuluksen päästyä siihen. Eräitä GAP proteiineja on p120GAP ja NF1.

• RAS-GTP on interaktiossa useisiin effektoriproteiiniperheisiin.

(1) Näistä ensiksi opittiin tuntemaan RAS-RAF-MEK-ERK-signalointitie. Aktiivi ERK stimuloi transkriptiotekijöitä, jotka voivat aktivoida solusykliä säätävien proteiinien ( kuten sykliiniD) ilmenemisen. Siitä aiheutuu solusyklin progressio.

(2) RAS-PI3K-PDK1-AKT . Tämä enstyymi PI3K johtaa sekundäärivälittäjäaineen PIP3 muodostumiseen ja se taas aktivoi kinaasin PDK1 ja AKT. AKT taas edistää solun elossapysymistä fosforyloimalla ja siten inaktivoimalla useita proaptoottisia proteiineja ( kuten BAD).

(3) RAS-PI3K-RAC (RHO-perheen GTP-aasi). Tästä tiestä säätyy aktiinisytoskeleton ja NF-kB välitteinen transkriptio.

(4) RAS-TIAM1-RAC

(5) RAS- RAL-GEF (RAL-GDS). Tämä on eräs toinen RAS-perhe, joka stimuloi RAL, joka aktivoi PLD entsyymin. Arvellaan, että RAL-GDS tie osallistuu Forkhead-transkriptiotekijöitten estämiseen, jolloin edistyy solusyklin progressio ja solun elossapysyminen. Rakkuloitten kuljetus vaikuttuu.

(6) RAS-PLC. PLC aktivaatio johtaa entsyymin PKC ( proteiinikinaasi C) aktivaatioon. Tässä on myös kalsiumsignalointia.

RAS-signalointijärjestelmässä on ainakin kaksi mutaatiokohtaa.
 Toinen koskee RAS-aktivaatiota ja toinen GAP-inhibitiota.
Mutaatiot niissä johtavat RAS hyperaktivaatioon.

• Inhibiittorikehittely

On kehitelty FTI ja GGTI lääkeaineita, farnesyylitransferaasin inhibiittoreita geranylgeranyltransferaasin inhibiittoreita etsittäessä syövänvastaisia lääkeaineita. Tästä asiasta on paljon tekstiä tässä väitöskirjassa.

Statiinin osuus isoprenylaatioissa on molempien , farnesylaation ja geranylgeranylaation epäspesifistä estämistä varhaisvaiheessa tarkoituksella vähentää kolesterolin muodostumista, mutta on havaittu muitakin vaikutuksia.

IPP-lipidien synteesin määrän aleneminen
(1) vähentää kolesterolin synteesiä
(2) vähentää GGPP synteesiä ja kalvoon kohdistumista
ja (3) aiheuttaa apoptoosia tuumorisoluissa.
..

SKVALEENI adjuvanttina

AS03 adjuvantti, joka sisältyy Pandemrix rokotteeseen, stimuloi immuunivasteen kehittymistä

Ruotsissa (ja Suomessa) käytössä oleva uusi rokote Pandemrix sisältää lisukkeen adjuvantin AS03, joka on immunostimuloiva vaikutukseltaan AS03 sisältää skvaleenia, DL-alfa-tokoferolia ja polysorbaattia”80”. Tarvitaan tällaista adjuvanttia, jotta kehkeytyisi tarpeeksi immuunivastetta rokotevirukselle, koska se on aivan uusi ihmisen immuunijärjestelmälle ja rokoteen influenssa-antigeenimäärä on vähäinen. Ne kliiniset kokeet, mitä tällä adjuvantilla (lisukkeella AS03 ) on tehty ja eräällä toisella adjuvantilla, eivät ole osoittaneet vakavia riskejä , kertoo Läkemedelsverket

(1) Rokotteen tarkoitus on indusoida (saada aikaan) immuunivaste rokotteeseen kuuluvia komponentteja kohtaan. Komponentit voivat olla viruksesta tai bakteerista käsin ja tarkoitus on suojautua tulevaisuudessa sen saman tekijän aiheuttamaa infektiota vastaan.

(2) Jotta voitaisiin saada aikaan riittävän vahva immuunivaste, aina ei ole riittävää käyttää vain virusperäisiä osia tai bakteerin osia, vaan joudutaan lisäämään immuunijärjestelmää stimuloivia tekijöitä ja niitä sanotaan adjuvantiksi.

(3) Kauan on ollut epäselvää, miten adjuvantti oikein toimii.

(4)Nykyään tiedetään, että immuunivaste virus tai bakteeritulehduksessa

(5) Ne solut, jotka vastaavat spesifisellä immuunivasteella ja vasta-aineentuotolla (T- ja B-imusolut), vaativat aktivoituakseen apua muilta immuunisoluilta kuten makrofageilta, dendriittisoluilta ym.

(6) Ne solut taas aktivoituvat siten, että ne tunnistavat joitain erikoisia rakenteita joko bakteerien pinnalta sen jälkeen, kun jokin elävä virus on infektoinut solua tai kudoksesta, jos kudosta on vaurioitunut

(7) Sellaisessa rokotteessa, jossa on vain joitain tarkoin valittuja osasia viruksesta tai bakteerista hiven tarjolla, tapahtuu tuota aktivointia vain hyvin mitättömässä skaalassa.

(8) Mutta kun lisätään jotain adjuvanttia, seuraa tilanne, joka muistuttaa infektion normaalia kulkua ja silloin voidaan saada aikaan voimakkaampi immuunivaste .

(9) Samalla voitaneen tässä yhteydessä mainita, että rokotteet ovat nykyään paljon puhtaampia kuin entisaikaan.

(10) Entisiin rokotteisiin sisältyi merkitsevästi enemmän virus- ja bakteeriperäisiä epäpuhtauksia, joten sellaiset samalla saattoivat toimia adjuvanttina.

(11) Kausiluontoisia influenssoja vastaan rokotettaessa saadaan useasti riittävä vaste ilman adjuvanttia. Se johtunee siitä, että useimmat ovat jo aiemmin altistuneet kausiluontoista influenssaa muistuttavalle infektiolle. Silloin on jo eräänlainen immunologinen muisti kehossa ja silloin immuunijärjestelmän on helpompi vastata uuden influenssakannan haasteeseen. Mutta pandemiassa keholla ei ole sellaista muistia olemassa, vaan virus koetaan immuunijärjestelmässä aivan uutena. Sen takia immuunivaste tulee olemaan paljon heikompi adjuvanssin puuttuessa.

(12) Lisäsyy, miksi adjuvanttia tarvitaan on se, että on aivan liian vähän resursseja tuottaa influenssa-antigeenia, niin että sitä riittäisi tarpeeksi moneen rokotteeseen. Pandemianvastaisesta rokotteesta on globaali –maapallon laajuinen tarve. Jotta saadaan tuotettua riittävästi rokotetta on arvioitu siten, että varsinaista influessa-antigeeniä asetetaan mahdollisimman vähän yhteen rokotteeseen. Kausiluontoisen influenssan vastaiseen rokotteesen asetetaan yleensä yhteesä 45 ug (mikrogrammaa) influenssa-antigeeniä. Niitä tulee silloin kolmesta viruskannasta, jokaisesta 15 ug. Mutta Pandemrix sisältää vain 3,75 ug influenssa-antigeeniä. Niissä tutkimuksissa, joita on tehty kehiteltäessä Pandemrixrokotetta, on käytetty erästä prototyyppiä, joka on H5N1 viruksesta ( lintuinfluenssaviruksesta). Näissä tutkimuksissa on osoittautunut selvästi, että adjuvantin lisää tarvitaan, jotta saadaan riittävän voimakas immuunivaste ja hyvä suojavaikutus kahden rokoteannoksen jälkeen.

(13) Adjuvantista yleensä on laaja kliininen kokemus. Eräs adjuvantti mitä laajalti käytetään, on alumiinihydroksidi. Sen on monissa rokoteissa osoitettu vaikuttavan vahvaa vasta-ainevastetta ja hyvää suojavaikutusta. Muyta se ei ole osoittautunut olevan niin hyvä teholtaan influenssarokotteita kehiteltäessä.

(14) On olemassa muitakin adjuvanttijärjestelmiä, joita on tutkittu prekliinisesti ja kliinisesti. Jo 1940-luvulla osoitettiin, että öljyn ja veden emulsiot toimivat vahvoina adjuvantteina. Alunperin kokeiltiin kehossa hajaantumatonta mineraaliöljyä. Mutta siitä näytti tulevan voimakas paikallinen tulehdus, joka oli kivulias eikä aina edes parantunut. Kun sitten vähennettiin emulsiossa olevan öljyn määrää ja kun alettiin käyttää sellaista öljyä, joka pilkkoutui kehossa, SKVALEENIA, niin on kehitetty adjuvantteja, josta tulee vähempia paikallisia sivuvaikutuksia.

(15) SKVALEENI on hiiliketju, jossa on 30 hiiliatomia ja 50 vetyatomia. Skvaleenia on normaalisti ihmiskehossa, ja se on aineenvaihdunnallinen välituote kolesterolimolekyylin synteesissä. Tavallisin lähde skvaleenille on hain maksan öljy.

(16) Ei tiedetä, millä tavalla skvaleeni tai muut öljyt vaikuttavat immuunivasteen vahvistamiseen. Arvellaan, että öljy vaikuytaa injektiokohdan immuunisoluja ärsyttävällä tavalla. Tämä ärsytys johtaa lievään inflammaatioon, mikä puolestaan vahvistaa immuunivastetta niitä antigeenejä vastaan, mitkä sisältyvät rokotteeseen.

(17) Skvaleeni ja Persian lahden sodan oireyhtymä. Skvalen och Gulf War Syndrome
Vuonna 2000 julkaistiin artikkeli, jossa osoittautui olevan yhteyttä skvaleenivasta-aineisiin ja Persian lahden sodan oireyhtymään, mikä tautitila kohtasi useita amerikkalaisia, jotka olivat olleet mukana Irakin sodassa 1990-1992. Myöhemmässä tutkimuksessa esitettiin tietoja, jotka osoittivat vasta-aineiden ehkä olevan peräisin pernaruttobakteeria ( Anthrax) vastaan kehitetystä rokotteesta, sen skvaleenista. Mutta sitten myöhemmän tutkimukset kumosivat nämä tiedot ja sanottiin, että anthraxin vastaiseen rokotteesen ei oltu lisätty adjuvantiksi skvaleenia ollenkaan. Toisissa tutkimuksissa on osoitettu, että jos rokotettiin yksilöitä influenssaa vastaan sellaisella adjuvantilla kuin MF59, joka sisältää skvaleenia, rokottaminen sinänsä ei lisännyt skvaleeninvastaisia antibodeja. Sitten samainen tutkimus osoitti myös, että monilla ihmisillä, joita koskaan ei oltu immunisoitu skvaleenia sisältävillä rokoteilla, myöskin osoittautui ilmenevän matalia pitoisuuksia skvaleenin vasta-aineita. Ja sitten tuli jälleen tutkimus, joka osoitti että Persianlahden sodan oireyhtymällä ja skvaleenivasta-aineilla ei ollut mitään yhteistä nimittäjää.

(18) Myös WHO on selvittänyt skvaleenin ja Persianlahden sodan oireyhtymän välistä korrelaatiota: WHO:n johtopäätös rokotteitten skvaleenista on seuraava. Pelot rokotteiden skvaleenin aiheuttamista patologisista anti-skvaleeni-vasta-aineista ovat perusteettomia.

WHO kuitenkin mainitsi, että kokemukset skvaleenia sisältävistä rokoteista perustuvat ainoastaan vanhempaan ikäluokkaan ja muihin ikäluokkiin skvaleenia sisältäviä rokotteita tulisi johdattaa varovaisesti ja tilannetta seuraten, jotta voidaan havaita kaikenlaiset rokotteeseen liittyvät haitalliset tapahtumat

WHO har utrett kopplingen mellan skvalen och Gulf War Syndrome. Deras slutsats angående skvalen i vacciner var följande:

“The Committee concurred that fears of squalene in vaccine-inducing pathological anti-squalene antibodies are unfounded. It did note, however, that the experience of squalene-containing vaccines has been primarily in older age-groups and recommended that as squalene-containing vaccines are introduced in other age-groups, careful post-marketing follow up to detect any vaccine-related adverse events needs to be performed.”

Skvaleeni ja autoimmuuninen niveltulehdus_ Skvalen och autoimmun artrit

(19) Adjuvantti-niveltulehdus on kokeellinen malli nivelreumaa, mitä on jo pitkään tutkittu. Nimittäin ollaan voitu osoittaa, että Freunds Complete Ajduvans on sellainen vahva adjuvantti, jossa on mykobakteereita ja mineraaliöljyä ja rotilla se todellakin sai aikaan artriitin. Sittemmin pystyttiin osoittamaan että erittäin herkällä eläinkannalla (DA-rotta) saatiin indusoitua artiriitti heikommallakin adjuvantilla kuten epätäydellisellä Freundin adjuvantilla jossa oli vain mineraaliöljyä. Sitten keksittiin (1999 julkaistu tieto) että monilla muillakin adjuvanteilla oli moinen kyky, esim. skvaleenilla.

(20) Syy miksi nämä adjuvantit aiheuttivat niveltulehduksia ( artriitti) koe-eläimissä, oli vahva immuunijärjestelmän aktivoituminen.Ei niin, ettäkö muodostuisi immuunivaste adjuvantin ( kuten skvaleenin) komponenttia kohtaan( Öljymolekyylien katsotaan olevan itsessään mitättömiä immunogeenejä), vaan sen sijaan tämä vahva aktivoituminen aiheutti, että kehon lymfosyytit ( =autoreaktiiviset imusolut, osa valkosoluista), jotka pystyvät tunnistamaan kehon omia rakenteita, aktivoituvat ja sen takia tapahtui autoimmuunihyökkäys kehon omia kudoksia vastaan. Edellytyksenä on geneettinen rakenne( tietty koe-eläinlaji) sekä epäspesifisen immuuniaktiivisuuden vahvuus. Näissä pienten koe-eläinten tapauksissa käytetty skvaleenin ja adjuvanssiöljyjen määrä eläintä kohden, on ollut 200 ul, mikrolitraa / eläin. Mineraaliöljyn vesiemulsiolla 50/50 saatiin huomattavasti lievempi artriitti tulokseksi. Lisäksi jos asetettiin emulsioon antigeeni ( kuten kokeissa eräs ovoalbumiini), ei kehittynyt artriittia.

(21) Mitä relevanssia ihmisille on tällaisilla kokeilla on skvaleenia sisältävien adjuvanttien suhteen? Tiedot osoittavat, että skvaleeni sinänsä ei omaa mitään toksikologista aktiivisuutta, vaan kyse on sen adjuvanttisuuskyvyistä (kyvystä vahvistaa immuunivastetta), mikä taas oli artriitin kehittymisessä olennainen seikka. Lisäksi niissä (eläin)kokeissa vaadittuun voimakkaaseen inflammatoriseen aktiviteettiin tarvittiin injisoitu puhdas öljy. Kun sitten lisättiin jokin antigeeni adjuvanttiin, ei tapahtunut artriitin kehittymistä Tätä relevanssia verrataan rokoteasioihin: sillä rokotteeseen kuuluu olennaisena osana juuri ANTIGEENI, joka voi johdattaa herätetyn immunologisen valmiuden vasteen suuntaa..

(22) Adjuvantin ruiskuttamisesta seuraava vahva inflammatorinen reaktio on aina ollut pääasiallinen turvallisuusongelma adjuvanssin käytössä ihmisillä. Kuten edellä mainittiin, menneisyydessä on käytetty myös mineraaliöljyä ihmisillä adjuvanttina, mutta senkaltaisten tuotteiden käyttö nykyään on hyvin vähäistä, koska siitä seuraa niin vahva paikallisreaktio.

(23) Ne adjuvantit mitä nykyään käytetään, ovat ns. vesiemulsioita, jossa öljyn määrä on merkitsevästi vähäisempi ( 10-20 mg öljyä puolessa millilitrassa (0,5 ml) rokotetta). Tällaisista rokotteista tulee merkitsevästi vähäisempiä paikallisia reaktioita. Yhteenvetona voidaan myös päätellä, että se rokote, mitä ihmisiin käytetään, eroaa monessa suhteessa siitä materiaalista, mikä osoittautui aiheuttavan artriittia rotilla ja että sellaisia reaktioita ei sen takia odoteta esiintyvän rokotuksen jälkeen ihmisillä. Tätä vahvistaa myös laaja olemassaoleva kliininen kokemus skvaleenia adjuvanttinä käyttävistä rokotteista

(24) Ei voida kuitenkaan täysin sulkea pois sitä riskiä, että rokote-mitä-tyyppiä-tahansa jo geneettisesti edeltäkäsin alttiilla henkilöllä ja menossa olevaa autoimmuunista prosessia potevalla yksilöllä (jolla vielä ei edes kliininen tauti ole puhjennut) , voisi aiheuttaa autoimmuunisen reaktion esiin liipaistumisen. Tämänkaltainen riski voi olla jonkin verran suurempi, jos rokotteet sisältävät adjuvanttia, joka antaa vahvemmanpuoleisen immuunivasteen. Tämä teoreettinen riski- mitä kliinisissä kokeissa ei ole Pandemrix-rokotteella ja sen kaltaisilla rokotteilla vielä saatu osoitettua, on suhteellistettava A (H1N1)v influenssalta suojan saamiseen /hyötyyn) - Riski todennäköisesti ei eroa normaalin infektion seuraamuksena tulleista vastaavankaltaisista riskeitä.

(25) AS03
Tämän niminen on se adjuvantti, joka on Pandemrix rokoteessa. Sen sisältö on seuraava.

Skvaleenia, 10, 69 mg( milligrammaa)
E-vitamiinia , joka on DL-alfa-tokoferolia 11,86 mg ( milligrammaa)
Polysorbaatti80-nimistä molekyyliä 4,86 mg( milligrammaa)

Siis SKVALEENIN lisäksi on adjuvantissa myös DL-alfa-tokoferolia, mikä on E-vitamiinin toinen nimi. Arvellaan, että E-vitamiinilla on immuunistimuloivia ominaisuuksia ja koe-eläimillä sen on osoitettu vahvistavan immuunivastetta jonkin verran, kun sitä on liitetty vain skvaleenia sisältävään adjuvanttiin. Rokotteeseen lisätty E-vitamiini määrä vastaa suurin piirtein samaa, mika on normaali ravinnossa saatava päiväannos. Polysorbaatti80 taas on pinta-akviivi aine, jota käytetään stabilisoimaan adjuvanttiemulsiota. Polysorbaatti80 on käytössä monessa lääkeaineessa, myös sellaisissakin, joita injisoidaan.

(26) Pandemrix ja AS03 ovat läpikäyneet tavanomaiset toksikologiset tutkimukset eläimissä, eikä ole havaittu muita toksikologisia löytöjä kuin tulehduksellisia muutoksia injektiokohdassa. Aiemmin ei ole ollut olemassa mitään rokotetta, jossa olisi juuri tämä AS03 adjuvantti hyväksyttynä. Sensijaan on olemassa useita kliinisiä kokeita rokotteilla, joissa on sisältönä AS03. Paitsi Pandemrix-influenssarokotetta niin myös eräs kliinisesti tutkittu malariarokote sisältää AS03.

On olemassa tietue 12 000 ihmisestä, jotka ovat saaneet rokotetta, jossa on AS03. Ainoa sivuvaikutus, mikä voitiin yhdistää rokotteeseen oli paikallinen tulehdus ja lyhytaikainen kuumereaktio. Sellaisia reaktioita esiintyy myös laajalti muitten rokotteiden yhteydessä.

(26) Kausi-influenssarokotteessa on ollut adjuvanttina MF59.

Jos rokoteannos on puoli milliä (o,5 ml), niin siinä on seuraava koostumus tätä adjuvanttia.

Skvaleenia 9,75 mg ( milligrammaa)
Polysorbaatti80:tä 1,175 mg ( milligrammaa)
Sorbitaantrioleaattia 1m175 mg( milligrammaa).

Tätä MF59 adjuvanttia sisältuu kausi-influensarokotteeseen nimeltä Fluad, jota on käytetty 1990-luvulta asti. Tämä rokote on tarkoitettu vanhemmille henkilöille, yli 65 vuotiaille, joilla on yleensä huonompi vaste traditionaalisiin influenssarokotteisiin. Kliinisiin kokeiluihin osallistui noin 14 000 yksilöä, joista suurin osa oli täyttänyt 65 vuotta ja heidät rokotettiin tällaisella rokotteella. Ainoat sivuvaikutukset, joita on voitu yhdistää rokottamiseen, ovat olleet paikallisreaktioita. Sen jälkeen kun Fluad tuli hyväksytyksi, yli 40 miljoonaa yksilöä on jo rokotettu sillä. Seurannassa ei ole tullut esiin vakavien sivuvaikutusten lisääntymistä vertailtaessa ilman adjuvanttia tehtyihin influenssarokotuksiin.

(27) Loppulause_ Slutsats

Pandemrix-rokotetta kehiteltäessä (H5N1-sisältöisellä prototyyppirokotteella) tutkimuksista on saatu vahvistusta siitä, että rokotteen sisältämä matala influenssa-antigeenimäärä ei olisi riittävä immuunivasteen herättämiseen ilman adjuvanttilisää. Tehdyt kliiniset tutkimukset tällä AS03 adjuvantilla ja eräällä toisella adjuvantilla eivät ole antaneet merkkejä mistään vakavista riskeistä. Kuten sanottu teoreettinen riski Pandemrix-rokotteesta on punnittava influenssa A H1N1 rokotteesta saatavaan hyötyyn verraten. Riskien suuruus ei todennäköisesti eroa siitä riskien määrästä, mikä varsinaisesta taudista seuraa.
www.emea.europa.eu/humandocs/ Humans/EPAR/pandemrix/pandemrix.htm

www.who.int/vaccine_safety/topics/ adjuvants/squalene/Jun_2006/en/index.html

LÄHDE:

www.lakemedelsverket.se/Alla-nyheter/NYHETER-2009/Pandemrix--adjuvans-immunstimulerande-komponenter/

Statiini ja influenssa

LÄHDE: Fedson DS. Clin Infect Dis. 2006 Jul 15;43(2):199-205. Epub 2006 Jun 12.Pandemic influenza:a potential role for statins in treatment and prophylaxis. Fedson on ollut sitä mieltä, että statiineilla on potentielli osa sekä influenssan hoidossa että profylaksiassa.

Fedson kirjoitti vuonna 2006, että pandeminen influenssa saattaa olla aivan jo ovella. Ja koska antiviruslääkkeitä ja rokotteita ei ole saatavilla useimmissa maissa omille väestöille, olisi päätettävä, jos olisi muita kelvollisia valmisteita kliinisesti tehokkaaseen käyttöön.

Influenssa assosioituu aina akuutteihin kardiovaskulaarisiin sairastumisiin .
Influenssavirus indusoi proinflammatorisia sytokiineja.

Statiinit ovat kardioprotektiivisia ja niillä on anti-inflammatorisia sekä immunomodulatorisia vaikutuksia ja niistä syistä niillä saattaa olla edullisia vaikutuksia influenssapotilaissa.

Tämä HYPOTEESI pitäisi arvioida käyttämällä administratiivisia tietueita etsimällä vähempiä sairaalahoidontarpeita ja vähempiä kuolemia influenssaan liittyvissä tiloissa niillä henkilöillä, jotka käyttävät statiineja.

Näitten tutkimusten jälkeen tulisi seurata laboratoriotutkimukset statiineillä koe-eläimillä ja influenssainfektion soluperäisillä mallellaja sitten myöhemmin kliiniset kokeet. Positiiviset tulokset tällaisista tutkimuksista voisivat antaa lääkäreille kaikissa maissa jotain hoitokeinoa , jota voi tarjota pandemisen influenssan yllättäessä sekä terapiaan että profylaksiaan. Geneerisiä statiineja on saatavilla laajalti ja ne ovat lääkkeinä ekonomisia. Saattaa olla niinkin, että ne tulevat olemaan ainoa lääkeaine, joka pystyy vaikuttamaan globaalin pandemian kulkuun muutosta.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16779747?ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum


They might be the only agents that could alter the course of a global pandemic.

HDL-kolesterolin merkityksestä

Duodecim 2007; 123:1150 mainitsee lähteestä Circulation 2007; 115:1609 HDL-kolesterolin merkitystä valaisevantutkimuksen.

Tutkimus on itävaltalainen. Siinä oli havaittu, että sellaisilla henkilöillä, joilla esiintyi toistuvia laskimoveritulppia, oli tavallista vähemmän Apo A1 apolipoproteiinia veressään.

HDL-kolesterolin pääosana on A-1 apolipoproteiini.

ApoA-1:n pitoisuus on suuri , jos se on yli 1,30 mg/ml.
ApoA-1 pitoisuus on kohtalainen, jos se on 1,07- 1,30 mg/ml tasoa.
Apo-A1 pitoisuudet alle 1,07 ot matalia

Niillä henkilöillä, joilla todettiin suuret tai kohtalaiset ApoA-1 pitoisuudet veressään omasivat noin viidenneksen pienemmän veritulpanuusiutumisen todennäköisyyden verrattuna niihin, joiden ApoA-1 pitoisuudet olivat alle 1,07 mg/ml.

Tutkimukseen oli osallistunut 772 henkilöä, joilla oli ilmentynyt ensimmäisen kerran laskimoveritulppa. Heitä seuratiin 4 vuoden ajan ja sadalle heistä kehittyi uusiutunut tulppa.

Statiinit ja sepsis

Duodecim-lehdessä 2007; 123:113-6 kirjoitti Ville Valtonen aiheesta Statiinit ja sepsis. Hyöty vielä todistamatta.
Noin puoli miljoonaa suomalaista käyttää nykyisin statiineja lähinnä kardiovaskulaaristen sairauksien hoitoon ja ehkäisyyn.

• Statiini ovat alkuperältään luonnontuotteita, joita eräät mikrobit-lähinnä sienet- erittävät ympäristöönsä. Miksi jotkut sienet erittävät statiineja, on epäselvää.

Statiineilla on monia erilaisia vaikutuksia. Statiinit ovat esimerkiksi voimakkaita anti-inflammatorisia aineita, ja niillä on myös antimikrobisia ominaisuuksia (Terblanche et al. 2006).

• Arvellaan statiineilla olevan edullista vaikutusta septisten infektioiden hoidossa ja ehkäisyssä (Hackman et al. 2006): Kohorttitutkimuksessa (n= 35 000) statiinia käyttäneillä kardiovaskulaarisia tauteja ja diabetesta potevilla esiintyi 17 % vähemmän septisiä infektioita.

On myös toinen tutkimusaineisto puolen miljoonan henkilön väestöstä (1997- 2002, Thomsen et al. 2006). Tästä joukosta 5400 joutui sairaalahoitoon veriviljelypositiivisen septisen infektion vuoksi. Mortaliteetti bakteremiseen infektioon ennen sairalaantuloa oli sama potilailla, jotka olivat käyttäneet statiineja ja statiineja käyttämättömillä. Kuitenkin sairaalassa hoidetuilla henkiinjääneiden ryhmässä oli merkitsevä ero mortaliteetissa statiinin käyttäjien eduksi (8.4% , vert 17,5%). Siis statiineja käyttäneet toipuivat paremmin. Australiasta on pienestä ryhmästä( n= 438) sellainenkin tieto, että jo ennen sairaalaan joutumista sepsispotilailla, jotka käyttivät statiineja, sairaala-ajan mortaliteetti oli paljon vähäisempi (10,1%) verrattuna statiineja käyttämättömiin (23.1%). Ero korostui edullisesti niiden joukossa, jotka käyttivät statiineja myös sairaalassaoloaikana.

• Statiinien käytöstä keuhkokuumeen eli pneumonian aikana on hieman ristiriitaisia tuloksia. Kanadassa seurattiin 3400 potilasta, joilla oli avohoitosyntyinen keuhkokuume ja jotka tarvitsivat sairaalahoitoa. Statiineja saaneilla vaikutti olevan hieman pienempi riski joutua TEHO-hoitoon tai kuolla, mutta tämä ero ei ollut kovinkaan selvä.

• Miksi statiinit ovat edullisia sepsiksessä?

Tämä edullinen vaikutus voi perustua moneen eri mekanismiin.
Statiinit estävät keuhkoklamydian ja monen muun bakteerin ja sienen kasvua koeputkessa sekä koe-eläimellä. Statiinien anti-inflammatorinen vaikutus on hyvin dokumentoitu. Liian voimakkaan tulehdusreaktion katsotaan olevan septisissä infektioissa haitallista, ja vaimentamalla tätä statiinit voisivat olla hyödyllisiä sepsiksen hoidossa.

• Toisaalta, asiasta tiedtään vielä niin vähän, että sitä ei voi erityisesti soveltaa käytännössä, ennen kuin enemmän tieteellistä näyttöä on koossa. Toistaiseksi siis statiinien indikaationa pidetään ainoastaan kolesteroliaineenvaihdunnan saamista kuriin ja käyttöä kardiovaskulaaristen sairauksien ja diabeetikkojen metabolisten ongelmien hoidossa.

• Arvellaan, että statiineillä olisi influenssavirustakin vastaan jokin edullinen vaikutus, mitä myöskään ei ole riittävästi osoitettu. (Ps. Jos itse sairastun influenssaan , otan puoli tablettia simvastatiinia päivittäin).

• DUODECIM 5/2006 kirjoitti myös referaatin Statiinit nujertavat sepsiksen?
• Tässä tehtiin yhteenveto eräästä australialaisesta kliinisestä potilasaineistosta, jossa oli bakteerilöydös ja 85%:lla oli sairaalaan tullessa statiini käytössä. Statiini todettiin edullisesti vaikuttavaksi tekijäksi ja loppulauseena oli: Jatkuvatkohan tutkimukset siten, että kaikille bakteremiapotilaille aloitetaan statiinilääkitys?( intensive Care med 2006; 32:75)
  

Statiini tehostaa callusmuodostusta murtumassa

Statiini simvastatiini on edullinen murtumia vastaan. Tämä on havaittu sekä osteoporoottisten murtumien esto- että traumaattisten murtumien paranemisvaikutuksista, calluskehittymisestä. Vaikutus perustuu luuta resorboivien osteoklastienvähentämiseen ja täten luuta muodostavien solujen osteoblastien korostamiseen.

Tässä eläinkokeessa kytetiin aika suurta statiiniannosta 120 mg koe-eläimen painoa kohden päivässä. Näin on osoitettu statiinien anabolinen vaikutus luustoon. Usea eri statiini aktivoi luutamuodostavan proteiinin (BMP-2) promoottorin. Lisäksi simvastatiini ja atorvastatiinitabletit lisäsivät volyymiä BMP-2:sta johtuen Kaikki tulokset eivät ole johdonmukaisia. Julkaistut tutkimukset ovat keskittyneet osteoporoosiin. Tässä tutkimuksessa oli hiiren reisiluunmurtumia, jotka oli korjattu ydinnaulalla. Toinen ryhmä koe-eläimistä sai simvastatiinia 120 mg/ painokilo. Vielä 8. päivän callusmuodostumista ei voinut päätellä mitään. 14 päivän callusmurtumista simvastatiinia saaneilla poikkipinta-ala oli 53% laajempi kuin kontrolleilla. ja luu oli vahvempaa, energian otto oli lisääntynyt 150%. Jäykkyys ja elastisuus taas eivät eronneet kontrolleista. 21 päivän kuluttua murtumat olivat histologisesti parantuneet ja mekaaninen ero oli kadonnut. Simvastatiinia saaneilla myös kontralateraalisen luun poikkipinta-ala oli kasvanut, mutta luun vahvuudessa ei ollut lisääntymistä eikä energianotossa. Nämä tulokset viittaisivat murtumien uuteen hoitomahdollisuuteen.

LÄHDE: Skoglund B, Forslund C, Aspenberg P.

Simvastatin improves fracture healing in mice. J Bone Miner Res. 2002 Nov;17(11):2004-8. Department of Neuroscience and Locomotion, Faculty of Health Sciences, Linkoping, Sweden.

Kommentti: Tämä on hyvä tieto sikälikin, koska statiinien käyttö on hyvin yleistä ja moni saattaa pohtia, jos statiini on haitallinen luuston suhteen . Siis statiini vaikuttaa edulliselta luustolle.

Statiini osteoporoosia vastaan?

Statins against osteoporos?

STATIINIT kuten simvastatiini etc. alentavat kolestrolin synteesiä, mutta sivussa ne vaikuttavat luuston remodelling ohjelmaan vähentäen osteoklastien funktiopuolella osteoklasteja. Tämä merkitsisi, että kalsiumia pääsee paremmin inkorporoitumaan suureen varastoon, luustoon (osteoblastien avulla) , eikä silloin ole niin suurta vaivaa solunsisäisen kalsiumin integraatioissa pieniin organelleihin. Tämä merkitsee mm kaksinkertaista etua sydänpotilaalle, jonka angina pectoris voi vähentyä kun villejä kalsiumjoneja (Ca++) saa pois kriittisestä elektrisestä toimintakentästä.

http://www.spineuniverse.com/displayarticle.php/article2508.html
http://www.spineuniverse.com/displaygraphic.php/3024/cruz_fig1_350-CC.jpg

Tämä on mieletäni aika uusi ajatus.

28.4.2008 18:57 L Bright

Kolesteroli, konneksiini ja sydänlihassolu

Sydänlihaksen tärkeä kriittinen kanavarakennelma konneksiini43 vaikuttuu hyperkolesterolemiasta.

Tämä osoitettiin koe-eläimestä. Hyperkolesterolemia vaikutti sekä sähköisiin ominaisuuksiin että mekaanisiin ominaisuuksiin sydänlihaksessa.

Koska gap-junktiot(GJ), aukkoliitokset, ovat essentielli elektromekaaninen kytkentäverkosto kautta sydämen, tutkijat halusivat ottaa selvää konneksiini43:n (Cx43) ajallisesta esiintymästä, sydämen supistusfunktiosta ja johtumisnopeudesta- ja miten nämä kolme seikkaa korreloi keskenään.

Kun kolesteroli nousi, niin konneksiini43 pitoisuus laski kardiomyosyytissä, sydänlihassolussa. Jo 12 viikon aikana konneksiini43 pitoisuudet laskivat 60% oikein makoisalla kolesterolia kohottavalla dieetillä.
Lisäksi Cx43- konneksiinit alkoivat sijoittautua eri tavalla solun lateraalisessa kalvossa.

Kun konneksiinit laskivat, lisääntyi niitten Cx4 mRNA ja fosforyloitunut c-Jun N-terminaalinen kinaasi.

Kaiken kaikkiaan sydämen sisäinen myokardiaalinen supistus heikenty
i ja kammioitten systolinen suorituskyky väheni.
Johtuminenkin huononi.

Jos dieetti muutettiin 18 viikoksi, havaittiin supistumisparametrien ja Cx43 proteiinin esiintymisen vielä toipuvan ennalleen. Näistä tutkimuksista kävi ilmi, että kriittinen Cx43 on mitä selkeämmin osallisena sydämen supistustoiminnan häiriöissä ja rytmihäiriöisä.

Kommentti:
Voisi myös sanoa, että varhainen hyperkolesterolemian diagnoosi voi olla tärkeä, koska tilanne sydämen funktion kannalta näyttää – koe-eläimistä päätellen- olevan palautuva, jopa näitten herkästi iän mukana vaurioituvien ja denegeroituvien Cx43 konneksiinien osalta. Näyttää siltä, että joka ikä kannattaa pitää kolesterolistaan huolta, koska varsinkin tämä konneksiini vikuuntuu iän mukana.

LÄHDE: Lin LC, Wu CC. Downregulated myocardial connexin 43 and suppressed contractility in rabbits subjected to a cholesterol-enriched diet. Lab Invest. 2005 Oct;85(10):1224-37.

Statiini, prenylaation estäminen ja Alzheimerin tauti

Hakusanana:
APP, Abeeta ja Rab-proteiinin prenylaatio; Prenylation inhibition

LÄHDE 1. Vuodelta 2007

Ostrowski SM, Wilkinson BL,Statins reduce amyloid-beta production through inhibition of protein isoprenylation. J Biol Chem. 2007 Sep 14;282(37):26832-44. Epub 2007 Jul 23
www.jbc.org/cgi/content/abstract/282/37/26832

On epidemiologista näyttöä siitä, että pitkäaikainen HMG-CoA-reduktaasin estäjän käyttö siis statiinin käyttö, vähentää riskiä Alzheimerin taudin kehittymisestä.
(HMG-CoA reductaasi inhibitor = hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitors = statins)
Mutta kuitenkaan statiinivälitteinen protektio AD-tautia vastaan ei ole täydellisesti selitettävissä vain kolesterolipitoisuuksia alentavista vaikutuksista.

Kolesterolia alentavien vaikutusten lisäksi statiineilla on pleiotrooppisia vaikutuksia (pleiotropic actions ) ja nämä vaikuttavat alentamalla aineenvaihdunnallisten isoprenoidivälituotteiden pitoisuuksia. Näitä ovat geranylgeranyylipyrofosfaatit (GGPP) ja farnesyylipyrofosfaatit FPP.

GGPP= geranylgeranyl pyrophosphate
FPP= farnesyl pyrophosphate.

Pienten G-proteiinien perhe kuten Rho-ja Rab-perhe ( Ras- superperheestä) vaatii posttranslationaalisena modifikaationa prenylaation eli isoprenoidisten yksikköjen liittämisen C-terminaaliseen kohtaansa, jotta niistä tulisi esiin GTPaasi-funktiota.

On tutkittu neuroblastomasoluja ja kun niitä käsiteltiin statiineilla, niissä estyi Rho ja Rab- proteiinien kohdentuminen kalvoon ( =membrane localization) aivan niinkin matalilla statiinipitoisuuksilla kuin 200 nm, eikä tässä vaikuttunut mitenkään solun kolesterolin pitoisuus.

Tässä tutkimuksiessa osoitetaan ensimmäistä kertaa, että matalat, mutta fysiologisesti kuitenkin relevantit annokset statiinia estävät ensisijassa GTPaasien alaluokan isoprenyloitumisia.

ESIM: AD-taudille patognomonisesti amyloidiprekursoriproteiini (APP) hajoittuu proteolyyttisesti siten, että siitä generoituu (pahaa molekyyliä) beeta-amyloidia ( Abeta), joka on pääasiallinen komponetti AD taudin seniileissä plakeissa. Normaalisti ei muodostu Abeetaa, vaan APP hajoaa toisella tavalla olemattomiin jättämättä kertyvää massaa.

Tutkijat osoittavat, että jos proteiinin isoprenylaatiota estetään statiineilla, seuraa APP- proteiinimaterian akkumulaatio solussa, solun sisässä, koska Rab-perheen proteiinit , jotka kuljettavat rakkuloita kalvoon, estyvät.

Lisäksi, koska Rho-perheen proteiinien funktio myös estyy, vähene APP proteiinin -terminaaliset ( hankalat) fragmentit, koska lysosomeista riippuva hajoittaminen lisääntyy ( Asia ikäänkuin sulatetaan solun sisässä lysosomin vahvoilla entsyymeillä ilman, että kalvo häiriytyy)

Täten statiinin vaikuttama prenylaation inhibitio johtaa vähentyneeseen Abeeta-eritykseen eli kliinisen taudin aiheuttajaa muodostuu vähemmän.

Yhteenvetona: tutkijat osoittavat, että statiinit estävät selektiivisesti GTPaasin isoprenylaation kliinisesti relevanteissa lääkeannoksissa ja tämä johtaa alentuneeseen Abeeta tuottoon isoprenoideista riippuvalla tavalla .

Tämä tutkimus luo valoa siihen mekanismiin, mikä on takana statiinien AD- patogeenisyyttä vähentävässä vaikutuksessa.

LÄHDE 2. Vuodelta 2005
Cordle A, Koenigsknecht-Talboo J, Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. J Biol Chem. 2005 Oct 7;280(40):34202-9. Epub 2005 Aug 4.

HMG-CoA reduktaasien (= statiinien) on raportoitu alentavan Alzheimerin taudin riskiä. Nämä tutkijat ovat osoittaneet aiemmin, että statiinit estävät abeetan eli beta-amyloidin tulehduksellisen vasteen riippumatta kolesterolia alentavasta vaikutuksesta. Statiinit vaikuttavat anti-inflammatorisesti varsinkin estämällä Rho-proteiiniperheen ( pienten GTPaasien) prenylaatiota, joilloin nämä GTPaasit inaktivoituvat.

Tutkijat raportoivat myös mikogliakudoksesta, että Rho-perheen GTPaasien estäminen häiritsee mikrogliasolun sytoskeletonia ja vaikuttaa morfologisia muutoksia.

Mutta statiinit blokeeraavat Abeeta-proteiinin stimuloiman fagosytoosin estämällä Rac- funktion.

Paradoksisesti statiinien välittämä pienten G-proteiinien funktion inaktivoiminen liittyi Rac ja RhoA proteiinien lisääntyneeseen GTP-lataantumiseen ja tämä vaikutus oli havaittavissa myeloisen linjan soluissa ja muissa solutyypeissä.

Statiinikäsittely keskeytti Rac- interaktion negatiiviseen säätelijäänsä RhoGDI. Tämä interaktio taas on riippuvainen isoprenylaatiosta.
(Rho guanine nucleotide dissociation inhibitor; RhoGDI)

Tutkijat olettavat, että negatiivisen säädön puute heijastuu GTP:n latautumisena.

Rac-isoprenylaatiota vaaditaan myös tehokkaaseen interaktioon plasmamembraanin kanssa. He ovat sitä mieltä, että statiinihoito alentaa vahvasti Rac- proteiinin kapasiteettia asettua interaktioon kalvojen kanssa. Näistä tuloksista päätellään se mekanismi, jolla statiinit estävät RhoGTPaasien vaikutuksetn ja miedontavat Abeetan stimuloiman tulehduksen.

Kts rac- family ( Rho perhettä)

VIITE: http://en.wikipedia.org/wiki/Rho_family_of_GTPases
http://www.jbc.org/cgi/content/full/282/37/26832


LÄHDE3.

Khan MA, Gallo RM, Statins impair CD1d-mediated antigen presentation through the inhibition of prenylation. J Immunol. 2009 Apr 15;182(8):4744-5

Statiinien käyttö kolesterolia alentavana lääkkeenä on hyvin laajaa. Statiinit vaikuttavat lisäksi anti-inflammatorisesti ja niiden kohteena on silloin prenylaatiolle välttämättömät entsyymit Prenylaatio taas on tärkeä prosessi useille solufunktioille vitaalien proteiinien aktivaatiossa ja solun sisäisissä kuljetuksissa.

Tässä työssään tutkijat osoittavat, että statiinit tekevät kyvyttömäksi erään kriittisen komponentin luonnollisen immuniteetin ( innate immunity) vasteessa, nimittäin CD1d-välitteisen antigeenin presentaation

Jos lisättiin spesifisiä isoprenylaatioon kuuluvia välituotteita, tämä estoefekti poistui.

Jos taas spesifisesti kohdistettiin niihin entsyymeihin, jotka ovat vastaamassa prenylaatiosta,niiden estovaikutus muistutti samankaltaista estovaikutusta mikä statiineillakin oli CD1d- välitteiseen antigeenin esittämiseen MHC-II molekyyleillä.

Tämä työ osoittaa isoprenylaation tärkeyden antigeenin esittelyn säätelyssä ja viittaa siihen mekanismiin, millä statiinit vähentävät inflammatorista vastetta.

www.inchem.org/documents/ehc/ehc/v212eh07.gi

VIITE CD1

www.pnas.org/content/102/24/8668.full

Prenylaation estäminen, FTI, GGTI

Prenylaatio ja sen estäminen. Prenylation inhibitors= prenylaation estäjät.

Tausta varsinaisten prenylaation inhibiittorien kehittämisen tarpeelle.

Nämä estäjät tulee ryhmitellä aivan eri ryhmäksi, vaikka statiineillä, jotka laskevavat kolesterolipitoisuuksia, onkin matalin annoksin sivuvaikutuksena prenylaation estymisiä.

www.freshpatents.com/Prenylation-inhibitors-and-methods-of-their-synthesis-and-use-dt20070111ptan20070010561.php

Mutta tällä alalla ollaan vasta patenttiluetteloissa. Tässä on tutkijat tehneet inventaariota valmisteista, joista on hyötyä sellaisissa taudeissa, joihin liittyy proteiinien prenylaatio . Samalla luetellaan metodeja, millä proteiinin prenylaatiota voidaan estää ja miten valmisteita syntetisoidaan ja käytetään.

Luokka uusia yhdisteitä, joista on hyötyä proteiinien prenylaatioon liittyvissä taudeissa.

Ras-proteiinit ovat GTP-sitovien (pienten GTPaasi) proteiinien perhettä ja hydrolysoivat proteiineja, jotka säätelevät solujen kasvua ja differentaatiota.
Ras-proteiinien ylituotanto tai mutaatio voi johtaa solun kontrolloimattomaan kasvuun ja sellaisen on osoitettu olevan pahentavana syytekijänä useissa taudeissa kuten syöpä, uudelleen stenosoituminen, psoriaasi, endometrioosi, ateroskleroosi, virus ja hiivatulehdukset ja silmän sarveiskalvon (cornea) neovaskularisaatio.

www.nature.com/nri/journal/v6/n5/images/nri1839-f1.jpg

Ras-proteiinit omaavat yhteisenä piirteenä C-terminaalisen sekvenssin, jota merkitään CAAX-motiiviksi, jossa C tarkoittaa cysteiiniä , A tarkoittaa aminohappoa ja usein tämä on alifaattinen aminohappo. X on alifaattinen aminohappo tai jonkin muun tyypin aminohappo. Näiden proteiinien biologinen aktiviteetti riippuu niiden posttranslationaalisesta modifikaatiosta tähän sekvenssiin ja kyse on isopreenilipidiin liittämisestä, prenylaatiosta.

Jos proteiinilla on C-terminaalineen CAAX- sekvenssi, prenylaatio tapahtuu vähintäin kolmessa askeleessa ja
(1) siinä lisätään joko 15- hiilen farnesyyli (farnesyl) tai 20 hiilen geranylgeranyyli, isoprenoidi Cysteinyyli- tähteeseen
(2) ja samalla pilkotaan erikseen proteolyyttisesti kolme viimeistä aminohappoa C-terminaalista
(3) ja uusi C-terminaalinen karboksylaatti metyloidaan.
(4) Joidenkin proteiinien prenylaatiossa on neljäskin askel ja se on palmitylaatio farnesyloidusta cysteiinistä N-terminaalisesti sijaitseviin yhteen tai kahteen cysteiiniin

Ras-proteiinin kaltaiset proteiinit, joilla on C-terminaalinen motiivi XXCC tai XCXC , voivat myös prenyloitua ja ne prenyloituvat geranylgeranyylillä Cysteinyylitähteesen. Nämä proteiinit eivät tarvitse endoproteolyyttistä prosessoivaa askelta
Kun kuitenkin eräät soluproteiinit, jotka päättyvät XCXC, ovat karboksymetyloituja, ei ole kuitenkaan selvillä , jos karboksymetylaatio seuraa sellaistenkin proteiinien prenylaatiota, joilla on XXCC-motiivi.

Kaikille ras- proteiinien kaltaisille proteiineille on kuitenkin yhteistä, että isoprenoidin lisä on ensimmäinen prenylaatioaskel ja edellytys jatkoaskelille.

Proteiinien prenylaatiota katalysoi kolme entsyymiä.
(1) farnesyl-protein transferase (FPTase),
(2) geranylgeranyl-protein transferase type I (GGPTase-I),
(3) geranylgeranyl-protein transferase type-II (GGPTase-II, jolla on myös nimi Rab GGPTase).
Näitä entsyymejä löytyy niin hiivasta kuin imettäväissoluista.

FPTaasi ja GGPTaasi-I
ovat alpha/beta heterodimeerejä entsyymejä, joilla on samanlainen alfa-alayksikkö ja erilliset beeta-alayksiköt, tosin 30% niillä on aminohappojen samankaltaisuutta.

GGPTaasi II omaa erilaiset alfa ja beetaalayksiköt ja tekee kompleksia kolmannen komponentin kanssa. (REP, Rab Escort Protein), joka esittää proteiinisubstraattia alfa/beeta-katalyyttisille alayksiköille.

Jokainen näistä entsyymeistä käyttää selektiivisesti FPP tai GPP molekyyliä isoprenoidin donorina
FPP= farnesyl diphosphate
GGPP=geranylgeranyl diphosphate-

FPTaasi farnesyloi CAAX-motiivin sisältäviä proteiineja, joitten päädyssä on Ser, Met, Cys, Gln tai Ala (S,M,C,Q,A).
GGPTaasi-I geranylgeranyloi CAAX motiivin sisältäviä proteiineja, joiden päädyssä on Leu tai Phe (L, F).
Entsyymeille FPTaasi ja GGPTaasi-I on motiivi CAAX tetrapeptidi se minimaalisin
alue, mikä on vaadittavana edellytyksenä proteiinisubstraatti-interaktioon entsyymin kanssa.

Entsyymi GGPTase-II modifioi motiivin XXCC ja XCXC omaavia proteiineja, mutta sen interaktio proteiinisubstraatin kanssa on komplisoidumpi ja vaatii tunnistamisedellytyksenä muitakin proteiinisekvenssejä kuin C-terminaalisen tetrapeptidin:
Entsymologinen luonnehtiminen näistä kolmesta entsyymistä FPTaasi, GGPTaasi I ja GGPTaasiII viittaa siihen, että on mahdollista selektiivisesti estää vain yhtä näistä entsyymeistä.

GGPTaasi I siirtää geranylgeranyyliryhmän prenyylin luovuttajasta (GGPP) substraattiproteiini nCAAX terminaalin cysteiini- aminohappotähteeseen (C).

Tunnettuja GGPTaasi I kohteita ovat aivojen heterotrimeeristen G-proteiinien gamma-alayksiköt ja Ras-superperheen pienet GTP:tä sitovat proteiinit kuten RhoA, RhoB, RhoC, CDC42Hs, Rac1, Rac2, Rap1A ja Rap1B.

Proteiineillä RhoA, RhoB, RhoC, Rac1, Rac2 ja CDC42Hs on tehtävää solun muodon (shape) säätelyssä

Rac ja Rap proteiineilla on osuutta neutrofiilien aktivaatiossa.
Ras-proteiinien kyky vaikuttaa solun muotoon on riippuvainen Rho ja Rac-proteiinien funktiosta.

Koska Rho ja Rac-proteiinit vaativat geranylgeranylaatiota funktiokykyisyyteensä, GGPTaasi I:n estäjäaine ( inhibiittori) voisi blokeerata näiden proteiinien funktiota ja saattaisi olla hyödyllinen esim. syövänvastaisena aineena. Tätä huomiota tukee myös askettäiset tieteelliset tulokset.

ESIM. GGPTaasi-I inhibiittori voi jarruttaa tuumorisoluja, joilta puuttuu p53 G0/G1-faasista, ja estäjä voi aiheuttaa, että akkumuloituu p21 sup.WAP. Tästä voidaan päätellä, että näitä inhibiittoreita voidaan käyttää palauttamaan kasvun pysähdys ( growth arrest) sellaisissa soluissa, joista puuttuu funktionaalinen genominsuojelijatekijä p53, jonka tehtävänä on pysäyttää sellainen solu, joka ei ole pätevä solusykliin.

Sellaisissa soluissa, missä FPTaasi on inhiboituna, voidaan GGPTaasi I:lla modifioida erästä muotoa Ras-geeniä, mikä useimmin liittyy ihmisen syöpiin (K-Ras).

Koska geranyyligeranyloitu Ras on raportoitu olevan aivan yhtä tehokas kuin farnesyloitu Ras, kun tutkitaan solun transformaatioita, niin pitäisi kaikissa K-Ras- syövissä antaa hoitona myös GGPTaasiI-inhibiittoria.

Syöpähoidon lisäksi GGPTaasi I inhibiittoreilla saattanee olla käyttöindikaatioita interventiona muissakin patologisissa tiloissa. Näitä ovat esimerkiksi intima-hyperplasia, joka liittyy re-stenoosiin ja ateroskleroosiin.
Keuhkovaltimon sileän lihaksiston lihassolut ovat erityisen herkkiä GGPTaasi I –inhibitiolle ja sellaisten solujen hoitaminen GGPTaasi-inhibiittorilla johti niiden NOS-entsyymin superinduktioon IL-1-beta - interleukiinilla.
(iNOS = nducible nitric-oxide synthase (NOS-2). Tämän sieni-entsyymin selektiivinen estäminen vähentäisi soluseinämän integriteetti; tuhoo  sienisoluja.

Lukuisia muita prenylaation inhibiittoreita on tutkittu. Monia on vaikea eristää tai syntetisoida.

Katsotaan, että tämä on elävää tieteen haaraa, ja uusista prenylaation estäjistä ( prenyyli-proteiinitransferaasin estäjistä) on tarvetta.

(Inventaarion summana myös luetellaan rakenteeltaan näitä molekyylejä)

http://arthritis-research.com/content/figures/ar604-3-l.jpg

7.4.2009 16:36

Statiini, prenyyli, PI3K

Prenylaation ja Fosfoinositidijärjestelmän (PI)(ents.) suhteista ja STATIINISTA

Prenylaatiojärjestelmän alueella on tärkeä energiapakkaus GTP.
Fosfoinositidien energiajärjestelmässä taas on ATP/cAMP merkityksestä , myös CTP on olennainen.
Asiasta näyttää olevan uutta tietoa. (Maeda and Horiuchi) lähinnä SIMVASTATIININ osuudesta tässä kentässä.

Simvastatiini vaimentaa leptiinin expressiota eräissä adiposyyteissä ( 3T3-L1 adipocytes) aktivoimalla syklisenAMP-PKA tien, joka indusoituu proteiinin prenylaation estyessä.

Simvastatin suppresses leptin expression in 3T3-L1 adipocytes
via activation of the cyclic AMP-PKA pathway,
induced by inhibition of protein prenylation


SIMVASTATIINI estää 3-Hydroksi-3- metyyliglutaryylikoentsyymi A(HMG-A) reduktaasia, joka katalysoi HMG-CoA konversiota mevalonaatiksi, mikä on tahtia rajoittava askel kolesterolin synteesissä.

Tutkijat osoittivat, että SIMVASTATIINI pitoisuudessaan 1uM huomattavasti estää adiposyyttien differentiaatiota ( jota voi mitata preadiposyyttisten solujen 3T3-L1 -värjäyksellä). Samalla LEPTIININ-expressio ( LEPTIINI on adiposyyttien erilaistumisen merkitsijä) vaimeni SIMVASTATIINI-pitoisuudella 1 uM soluviljelmässä 12 päivään asti.

Mikä mekanismi oli taustalla, kun SIMVASTATIINI indusoi LEPTIINI- expressiota vähenemään?

Tutkijat käsittelivät nyt erilaistuneita 3T3-L1 adiposyyttejä
erilaisilla inhibiittoreilla
mevalonaatilla tai sen metaboliiteilla,
SIMVASTATIININ ollessa läsnä tai ilman SIMVASTATIINIA.

SIMVASTATIINI ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla vaimensi LEPTIINI mRNA-expressiota. Heterogeeninen nukleaarinen RNA, leptiini mRNA-linjasta, estyi 10 uM-pitoisella SIMVASTATIINILLA , kun taas mRNA stabiliteetti ei ollut muuttunut simvastatiinikäsittelystä transkriptio-pysähdytetyissä 3T3-L1-soluissa.

LEPTIINI-geenitranskription SIMVASTATIINI-peräinen -inhibitio ei kumoutunut esikäsiteltäessä proteiinisynteesin inhibiittorilla (cykloheximidillä).

Jos lisättiin mevalonaattia tai geranylgeranylpyrofosfaattia(GGPP), joka on mevalonaatin metaboliitti, poistui SIMVASTATIININ indusoima leptiiniexpression estymä näistä 3T3-L1 soluista.

(Prenylaation estäjän vaikutus)
Expression vaimenema oli havaittavissa, kun lisättiin GGTI-298 ( geranyyligeranyyli -transferaasi I entsyymin inhibiittoria), mutta sellaista vaimenemaa ei havaittu FTI-227 farnesyylitransferaaasin estäjää käytettäessä.

Jos käsiteltiin PI3K entsyymin estäjillä (fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi-inhibiittoreilla) joita on LY294002 ja wortmannin, väheni leptiinin expressio näissä 3T3-L1 soluissa.

SIMVASTATIINI annoksesta riippuvalla tavalla lisäsi solunsisäistä cAMP pitoisuutta 3T3-L1 soluissa ja maksimaalinen stimulaatio saatiin 10uM pitoisuudella.

GGPP lisääminen poisti SIMVASTATIININ indusoiman cAMP-kertymän –stimulaation ja PKA aktiivisuuden stimulaation.

H89, joka on PKA-estäjä, poisti täydellisesti simvastatiinin indusoiman LEPTIINI-expression vaimeneman.

Nämä tulokset viittaavat siihen, että SIMVASTATIINI vähensi geranylgeranyyliproteiinin prenylaatiota ja sitä seurasi PI3K deaktivaatio, mikä johti cAMP akkumulaatioon ja sitä seuraavaan PKA-aktivaatioon differentioituneissa 3T3-L1 adiposyyteissä.

Lopuksi PKA esti LEPTIINI-geenin transkription niin, että uutta proteiinia ei syntetisoitunut.


Reference List

Maeda, T. and N. Horiuchi. "Simvastatin suppresses leptin expression in 3T3-L1 adipocytes via activation of the cyclic AMP-PKA pathway induced by inhibition of protein prenylation." J.Biochem. (2009).

Prenylaatio Geranylgeranylaatio. Rab-proteiinit

Rab- proteiini vaatii prenyloitumista, geranylgeranylaation.

Se kuuluu Ras- superperheesen, jotka ovat pienien GTPaasien superperhe.
Small GTPase > Ras superfamily
Niitä ovat
Ras • Rab (Rab27) • Arf (Arf6) • Ran • Rheb • Rho family (RhoA, RhoB, CDC42, Rac1) • Rap

I Rab- SIGNALOINNISSA ON OLENNAISTA seuraavat tapahtumat.

Rab-GTPaasien kohdentaminen effektoriproteiinille ( vaikuttajaproteiinille)

(1) Rab GTPaasit voivat geranylgeranyloitua kahteen kysteiinitähteeseen (Cys) ja aivan samalla tavalla kuin Rho-GTPaasit, ne voivat olla sytosolissa GDI-sitoutuneena ( GDI on GDP-erkanemisen estäjä , (GDP-dissociation inhibitor) ja sitoo prenyyliryhmiä inaktiivista GDP-sitoutuneesta Rab- molekyylistä. (GDI sitoo vain inaktiivia Rab- muotoa).

(2) Rab-proteiinit voivat muodostaa trimeeri-kompleksin, jossa on Rab, GDI ja kalvoon liittynyt GEF. Tätä kompleksiliittymää voi välittää Rab-proteiinin hypervariaabeli domeeni.

(3) Kun sitoutumista tapahtuu, Rab-proteiinin prenyylisivukejtu siirtyy GEF:molekyyliin päin. GDP/GTP-vaihtumistekijä ( exchange factor)= GEF katalysoi konversiota GDP-muodosta GTP-muotoon.

(4) Samalla kun Rab aktivoituu, erkanee GDI molekyyli ja Rab- prenyyli vetäytyy siitä pois.

(5) Kun GDI on irronnut , niin( aktiivimuoto) GTPaasi on siten esillä että se voi sitoutua GEF:ään ja effektoriproteiiniin, jolloin on muodostunut aktiivi Rab- signalointikompleksi. plasmakalvolla. (Rab-effektori sitoo ainoastaan aktiivia GTP Rab muotoa).

II
Eräs toinen lähde mainitsee sivumennen, että Rab- proteiini geranylgeranyloituu ja että farnesylaation estäjä FTI estää myös geranylgeranylaatiota.
Proteiinin prenylaatiosta ( farnesylaatiosta ) . Sovellutusta normaaliin fysiologiaan, maligniin transformaatioon ja syöpäterapiaan. Farnesyylitransferaasin inhibio (FTI) voi ulottua geranylgeranyylitransferaasin inhibitioon.

• LÄHDE: Saïd M. Sebti Protein farnesylation: Implications for normal physiology, malignant transformation, and cancer therapy Cancer Cell, Volume 7, Issue 4, 297-300, 1 April 2005

http://www.cell.com/cancer-cell/abstract/S1535-6108(05)00101-7

PROTEIININ FARNESYLAATIO on isoprenoidirakenteen, lipidin lisääminen posttranslationaalisena modifikaationa, mikä vaaditaan syöpää aiheuttavaan proteiiniaktiivisuuteen kuten Ras-GTPaasi toimintaan.

Vaikka FARNESYYLITRANSFERAASIN ESTÄJIÄ (inhibiittorieta, FTI) on jo kliinisessä kokeilussa niiden vaikutusmekanismi ja proteiinien farnesylaation osuus normaalissa fysiologiassa oli vielä 2005 aikaan tieteessä osin hämärä seikka.
Tässä viitteen lehdessä Cancer Cell kaksi artikkelia valaisee näitä tärkeitä aihepiirejä:
PROTEIININ FARNESYLAATIO havaittiin essentiaaliksi alkion varhaiselle kehitykselle (embryogeneesi), mutta sitä vailla taas voi aikuisen homeostaasi olla. Toisaalta prenylaatio on taas kriittinen tuumorigreneesin progredioinnille, mutta ei sen alkamiselle.
Lisäksi, Rab geranylgeranyltransferaasi (GGTase)
tunnistettiin muutamien FTI ( farnesyylitransferaasi-inhibiittorien) kohdemolekyylinä.
Tässä pienessä katsauksessa keskustellaan löytöjen sovellutuksista normaalin fysiologian, malignin transformaation ja syöpä terapian aloilla.

III Rab- proteiinista, pienestä G-proteiinista mainintaa
Lähde Wikipedia

• Rab

Rab-proteiiniperhe kuuluu Ras-superperheeseen, jonka proteiinit ovat monomeerisiä G-proteiineja.

On löydetty ainakin 70 eri tyyppistä Rab- proteiinia ihmiseltä.
Rab-GTPaasit

• säätelevät monia kalvokuljetuksen vaiheita ja niihin kuuluu
• rakkuloitten ( vesicle) muodostuminen
• rakkuloitten liikkuminen (vesicle movement) pitkin aktiini ja tubuliiniverkkoston kautta
• kalvofuusio ( membrane fusion).

Nämä prosessit tekevät sen reitin, jonka kautta solun pintaproteiinit (Cell Surface proteins) liikennöivät Golgin laitteesta plasmakalvoon (PM) ja sitten taas tekevät uudelleenkiertoaan ( recycle) .
Pintaproteiinien kierrätys palauttaa sellaisia proteiineja pintaan, joiden funktioon kuuluu kuljettaa jotain toista proteiinia tai substanssia solun sisään, esimerkisi transferriinireseptoria,
tai sitten ne toimivat tietyn tyyppisten pintaproteiinimolekyylien lukumäärän säätelykeinona.
Rab-proteiinit ovat perifeerisiä kalvoproteiineja ja se tarkoittaa, että ne ovat ankkuroituneena kalvoon lipidiryhmällään, joka on kovalenttisesti liittynyt aminohappoon. erityisesti kahteen C-terminaaliseen kysteiiniin.

• REP

Rab- escort protein, (REP) välittää vastasyntetisoitunutta ja prenyloitunutta Rab-proteiinia päätekohtaansa plasmakalvoon (PL) sitomalla hydrofobisia , liukenemattomia prenyyliryhmiä ja kuljettamalla Rab- proteiinia sytoplasman kautta. Lipidi-prenyyliryhmät voivat kiinnittyä kalvoon ja täten Rab ankkuroituu rakkulan sytoplasmiselle pinnalle tai plasmamembraanin. Koska Rab- proteiinit ovat ankkuroituneina kalvoon taipuvan C-terminaalisen alueen kautta niitten voi ajatella toimivan kuin ”pallo jousen päässä”, 'balloon on a string'.

(Kun on syntynyt uutta Rab- proteiinia, REP-Rab- kompleksi liityy katalyyttiseen dimeeriin Rab GGTaasi ( geranylgeranyltransefraasi) joka siirtää geranyyligeranyyliryhmän GG-PP molekyylistä Rab- proteiinille. Geranyloitunut Rab pysyy liittyneenä REP- eskorttiin ja kuljetetaan johonkin Rab- spesifiseen kohteeseen. Tämä tarkka kuljetus on aivan välttämätöntä alkion kehityksessä, embryogeneesissä).

Kuten muut GTPaasit Rab myös omaa vaihteen ( switch) kahden konformaation( struktuurin) kesken: "OFF", inaktiivin GDP- ( guanosiinidifosfaattiin) sitoutuneen muodon ja "OFF" ,  aktiivin GTP- (guanosiinitrifosfaattiin) sitoutuneen muodon välillä.

• GEF

GDP/GTP-vaihtumistekijä ( guanosiini nt.  exchange factor) CEF katalysoi konversiota GDP-muodosta GTP-muotoon.

• GAP

GTP ( energisimmän fosfaattimuodon) hydrolysoituminen GDP-muotoon on GAP-katalysoitua. (GAP= GTPase activating protein).

• REP- kuljettajat kuljettavat vain GDP-sitoutunutta Rab- muotoa.( Kohdeproteiineja ei kaikkia tiedetä).

• Rab- effektorit ( proteiinit joihin Rab on interaktiossa) ja joiden kautta ne vaikuttavat) sitovat ainostaaan GTP-sitoutunutta Rab- muotoa. Nämä Rab- effektorit ovat hyvin heterogeeninen ryhmä ja jokaisella Rab- isoformillakin on monia effektoreita, joitten kautta ne suorittavat monenlaisia funktioita.

Rab kierrättyy
Sen jälkeen kun Rab on ollut fusoitunut kalvoon, se kierrättyy uudestaan alkuperäiseen membraaniinsa.

• GDI GDP-erkanemisen estäjä , (GDP-dissociation inhibitor) sitoo prenyyliryhmiä inaktiivista GDP-sitoutunutta Rab- molekyyliä ja estää että se ei pääse aktivoitumaan ( että GDP ei muutu GTP-muotoon) ja johdattaa Rab molekyyliä alkuperäiseen kalvoonsa.

Jos proteiinin prenylaatio on viallinen, seuraa häiriöitä kuten esim chorioidemia

• Eri tyyppisiä Rab-proteiineja

Rab18
Rab1 (YPT1) ER, Golgin laite
Rab2 ER, cis-Golgin verkosto
Rab3A, eriterakkulat
Rab4, varhaiset endosomit
Rab5, varhaiset endosomit klatriinipäällysteiset rakkulat, plasmakalvo
Rab6, keski-Golgi ja trans-Golgi
Rab7, myöhäinen endosomi
Rab9, myöhäinen endosomi ja trans-Golgi
Rab11, uudelleen kierrättyvä endosomi, lipidipisarat, Golgi, ER
Sec4, eriterakkulat
Muita Rab- proteiineja
Rab6 Rab6a, Rab6b, Rab6c
Rab13
Rab27

Proteiinien prenylaatio (Ras/Rho esimerkkinä)

Proteiinin prenylaatio
Esimerkkinä proteiinin prenylaatiosta Ras-superperheen proteiini solusta.

Ras/Rho järjestelmä
Rho-proteiinit kuuluvat Ras-superperheeseen. Ras-superperhe vaatii prenylaation ankkuroituakseen.

Rho-perhe taas on GTPaaseja, joissa GDP-sitoutunut muoto Rho-GDP on inaktiivi ja Rho- GTP-on aktiivi.

Ras-proteiinit alternoivat inaktiivin ja aktiivin muodon välillä, mikä tekee niistä molekyläärisiä vaihteita( switch) signaaliteihin. , jotka koskevat kasvua ja erilaistumista ( differentaatiota).

PRENYLAATIO on prosessi, joka käsittää hydrofobisen isoprenoidiryhmän liittämisen Ras-proteiinin C-terminaaliseen päätyyn. Prenylaatiossa liittyy joko farnesyyli(F) tai geranylgeranyyli(GG) tähde Ras-proteiinin C-terminaaliin. (KTS. kuva missä Ras proteiini on ankkuroitunut plasmakalvon sisäpintaan. Ankkurikohta on tätä isoprenoidia)
http://www.nature.com/nrm/journal/v5/n5/images/nrm1365-f4.jpg
¨
MEVALONAATTI-tie antaa isopreenirakenteita kuten farnesyylipyrofosfaattia FPP ja geranyyligeranyylipyrofosfaattia GGPP ja niistä saadaan F- ja GG- tähde proteiinien prenylaatioihin. Siirtämisen tekevät entsyymit nimeltään prenyylitransferaasit.
Hydrofobi prenyyliryhmä ankkuroi Ras-superperheen proteiineja intrasellulaarisiin kalvoihin siten, että ne voivat translokoitua plasmamembraaneihin.
Lopullinen sijoittautuminen ja fiksoituminen solukalvoon on välttämätön Ras-proteiineille, jotta ne voisivat osallistua lopulliseen spesifiseen interaktioonsa..

STATIINI-lääkeaineet alentavat FPP ja GPP tuottoa ja jatkotuotteita, mitä tulee mevalonaattitiestä tarkoituksella kuroa kolesterolimolekyylin syntymistä. Näin STATIINIT ( riippumatta LDL:stä) vuorovaikuttavat solunsisäisesti Ras-superperheen proteiinien funktioon.
Muun muassa STATIINIT alentavat matrix-metalloproteinaasin MMP-1 ilmenemistä estämällä Rho-järjestelmää.
Jos STATIINI –lääke poistetaan, Rho-GTPaasi-geeni transkriptio vaikuttuu negatiivisella feedback säätelyllä ja nyt esim. endoteliaalisen NO molekyylin tuotto vaimenee.

(HUOM: Tämä Ras/Rho järjestelmä omaa laajan vaikutuskirjon, joka valkenee katsomalla erilaisia karttoja, missä eri signaaliteitä otetaan käsiteltäväksi)

http://www.nature.com/emboj/journal/v20/n4/abs/7593581a.html

Eräs teksti asiasta on tämänlainen:

Ras geeniä sanotaan onkogeeniksi, koska se vaikuttaa tumavälitteisesti monenlaisia muuntumisia, transformaatioita, jotka voivat olla myös maligneja.

”Ras-Onkogeenin välittämät transformaatiot vaativat Rho-perheen GTPaasi-funktiota
Ras- transformoiduissa soluissa on kohonnut pitoisuus RhoA-GTP, mikä toimii estämällä solusyklin inhibiittorin p21/Waf1 expressiota (the cell cycle inhibitor p21/Waf1)- siis "estää jarrua toimimasta".

Nämä korkeat Rho-GTP pitoisuudet eivät ole aivan suora seuraamus Ras-signaloinnista, vaan ne valiutuvat esiin vasteena jatkuvalle (sustain) ERK-MAP-kinaasi-signaloinnille.

Kun nyt korkeat Rho-GTP pitoisuudet kontrolloivat p21/Waf pitoisuuksia, ne eivät enää säätelekään aktiini-stressisäikeitten muodostumista transformoituneissa soluissa.

Tutkijat osoittivat, että (onkogeenisen Ras välitteisestä transformaatiosta johtuen ) ERK-MAP-kinaasin jatkuva päälläolo sääti vaimenemaan ROCK1 ja Rho-kinaasit. Nämä ovat kaksi effektoria, jotka vaaditaan aktiini-stressisäikeitten muodostukseen.

Kun nyt Rho-tekijästä riippuva aktiini-stressisäikeitten muodostus on vaimentunut ERK-MAPK signaloinnista, tämä vaikuttaa Ras-transformoituneissa fibroblasteissa lisääntynyttä motiliteettia( liikkuvaisuutta).
ROCK-kohdekinaasin LIM-kinaasin yliesiintymä voi ennallistaa stressisäikeet ja estää Ras-transformoituneitten fibroblastien motiliteetin.

Tässä tutkijat esittävät johtopäätöksenään, että Ras ja Rho signalointiteiden vuorovaikutus edistää sellaisia signalointiteitä, jotka suosivat transformaatioita.

(Rho kinase, a promising drug target for neurological disorders)

Tämä Rho/ROCK/LIM kinaasisignalointitiejärjestelmä on eräs dominoiva signalointijärejestelmä , joka osallistuu tuumoreitten metastoimiseen. Siitä löytyy paljon asiaa internetissä.

http://www.curehunter.com/public/pubmed15026997.do

"Tumoreitten metastoimisessa on olennaista, että syöpäsolu pystyy liikkumaan paikasta toiseen ja invasoitumaan kudoksiin. Tällaisissa metastaattisissa soluissa solujen kiinnittyminen on muuntunut (adheesio) ja niiden liikkuvuuskin, motiliteetti, on muuntunut, kun niitä tutkitaan koeputkissa kemotaktisuutta analysoimalla.

Tässä metastasoinnissa juuri on häiriintynyt Rho/ROCK/LIM kinaasi tie- avainasemassa, sillä se osallistuu normaalisti aktiini-sytoskeletonin säätelyyn.

Eräät tutkijat käyttivät ribozyymikirjastoa(Rz) ja valitsivat summassa erään ROCK-proteiiniin kohdistuvan ribozyymin. Ribozyymi tuota ROCK tekijää vastaan poisti metastaattiset ominaisuudet.

Sitten he halusivat määrittää LIM-kinaasi2- spesifisen ribozyymin vaikutuksen fibrosarkoomasolun metastaattisuuteen ja proliferoituvuuteen. He kohdistivat LIM-kinaasi 2-expressioon ribosyymejä(Rz). Tehokas Rz valikoitiin esiin expressioanalyysiin perustuen. Sitten soluja transfektoitiin Ribozyymillä joka oli spesifisesti tehokas LIMK-2 vastaan ja sitten tutkittiin metastaattiset ja proliferatiiviset ominaisuudet.

Tuloksenaan he sanoivat, että solufenotyyppien analyysit sellaisenaan kuten vaikutus soluproliferaatioon, solumigraatioon ja kolonisoitumisiin, viittaavat siihen , että LIMK-2 expression vaimenema ihmisen fibrosarkoomassa rajoitti solujen migraatiota ja tiiviitten kolonioitten muodostamiskykyä vaikuttamatta solun proliferaatiotahtiin tai elinkykyyn.
Johtopäätös: LIMK-2 spesifisen ribozyymin kohdistaminen tuumorin metastaattisia ja maligneja ominaisuuksia vastaan voi toimia tehokkaana terapiana invasiivisissa tuumoreissa haitan ollessa minimaalista ympäröivissä normaaleissa soluissa.

Mevalonaatista dolikolia

MEVALONAATTITIEN MOLEKYYLI DOLIKOLI ( ja kolesteroli)

LÄHDE: Sindelair Pavel J. Hepatic lipase and dolichol esterification. Umeå universitet 1997
ISBN 91-628-2772-3

DOLIKOLI on yksi mevalonaattitien päätetuote, jonka vaikutus on fosfolipidikalvoa destabilisoiva ja permeabiliteettiä lisäävä. Dolikoli on glykoproteiinien (gp) N-linkkiytyneitten oligosakkaridien synteesissä obligatorinen välituote. Dolikoli on rakenteeltaan primääri alkoholi ja siinä on 16-23 kpl isopreeniosia.
Dolikolia esiintyy
vapaana,
monofosforyloituna ( dolikyylifosfaattina, dolichyl-P)
tai rasvahappoesterinä.

Tässä väitöskirjassa tunnistettiin ja luonnehdittiin dolikolin esteröitymisessä mukana olevia entsyymejä ja täten hankittiin tietoa tämän lipidin mahdollisista funktioista.
Koe-eläimessä 2% dolikoli-liposomi-infuusio vaikutti dolikolin esteröitymisen verenkierrossa. Liposomi oli tavallisista lesitiineistä ja kefaliineista tehty. Hepariini lisäsi dolikolin esteröitymistä rasvahappoon: Jos koe-eläin oli edeltä heparinisoitu, esterinmuodostus lisääntyi vahvasti.Tästä pääteltiin, että plasman hepariinilla on kykyä vapauttaa jotain entsyymiä. Osoitettiin kuitenkin, että LCAT entsyymi se ei ollut Myös heparinisaation jälkeenkin oli plasmalla aktiviteettia dolikolin asyloimiseen eli rasvahapon lisäämiseen dolikolimolekyyliin.

Entsyymi osoittautui dolikoli- transasylaasiksi, joka otti rasvahapon lähinnä fosfolipidilajeista PE ja PS ( kefaliini ja fosfatidylseriini). Fosfolipidien glyseryylitumasta vain sn1-aseman rasvahappo tuli käytetyksi transasylaatioon, joka taas käytti dolikolimolekyyliä, mutta EI kolesteroli tai retinolimolekyyliä.

Dolikoli-trans-asylaasi (Mp. 61 kD) osoittautui samaksi kuin hepaattinen lipaasi. Hepaattisen lipaasin katalysoimaa dolikolin esteröitymistä rasvahappoon stimuloi vahvasti plasmassa oleva ko-faktori, joka muutti pH-optimia happamemmaksi.(pH arvoon 7,5) Tämä kofaktori on assosioitunut HDL:ään. Lipoproteiinittomasta HDL-fraktiosta puhdistettu kofaktori osoittautui olevan apoA-IV. Apo A-IV stimuloi vahvasti fosfolipidien hydrolyysiä ja esti täydellisesti triglyseridien hydrolyysin lipoproteiineissa HDL-2 ja VLDL.
YHTEENVETO Hepaattisen lipaasin (dolikoli-trans-asylaasin) tärkeä kofaktori lienee Apo A-IV pitoinen HDL:


Kertauksena mevalonaattitien synteesissä mainituista molekyyleistä:
Tavallinen aktivoitu etikkahappo, asetyyli-CoA, on endogeenin kolesterolin synteesin alkuaine.
Aktivoitu asetoetikkahappo, asetoasetyyli-koentsyymi-A
HMG-CoA ( hydroksimetyyliglutaryyli-koentsyymi-A) ( Tässä kohtaa vaikuttaa tehokkain kolesterolinmuodostuksen estäjä, HMG-CoA-reduktaasin estäjä)
Mevalonaatti
Mevalonaattifosfaatti ( mevalonaatti-P)
Mevalonaatti-PP
Isopentenyyli-PP, (IPP)
Dimetyyliallyyli-PP (DMAPP)
Geranyyli-PP (GPP). Tästä voi tulla korkealla affiniteetilla Solanesyl-PP ja siitä ubikinonia.
Farnesyyli-PP. Tämä FPP on kohta. josta voi tapahtua monta vaihdetta eteenpäin.

1. Proteiinien isoprenylaatio ( hyvin korkea affiniteetti) (Esim G-proteiinien posttranslationaalinen isoprenylaatio).

2. Entsymaattisesti plasmassa (trans-prenyylitransferaasilla) geranyl-geranyl--PP (GGPP), tästä voi tulla menakinonisivuketjuja ( K2-vitamiinisivuketjuja, joita tarvitaan luussa, koagulaatiotekijöissä, aivojen K1-vitamiinin sivuketjussa MK-4)

3. Solanesyyli-PP. Tästä voi tulla ubikinonia

4. Luonnollisesti FPP voi myös muuttua syntetaasilla skvaleeniksi ja siitä kolesteroliksi ( matala affiniteettitie).

5. Cis-prenyylitransferaasilla polyprenyyli-PP ( korkea affiniteetti) Tästä voi tulla dolikoli tai dolikyyli –PP

Sellainen entsyymi kuin biotiini vaikuttaa FPP:n vaihteen valinnoissa




On huomattava eräs seikka. Dolikolista osa fosforyloituu dolikyylifosfaatiksi Dolikyl-P Se ei ole kaikkein edullinen muoto. Se liittyy kovalentisti proteiiniin maksassa.. Aivoissa tällä kovalenttisella liittymällä on merkitystä bioelektristen terminaalien stabiloijana ja isoloijana. Sitä täytyy olla tietty osa, mutta patologisissa tiloissa sen määrä kohoaa kuten Alzheimerin taudissa.

Suurin osa dolikolia on kefaliinissa sijaitsevaa ( fosfolipidi PE). Kun dolikolia rikastuu membraanin keskiseen osaan, lisääntyy fluiditeettti, kalvon nestemäisyys. Vetisyys, ja permeabiliteettti, kalvon läpäiseväisyys, joten se on destabilisaattori, kun taas kolesteroli tekee kalvosta vettäläpäisemätöntä, rasvaista. Dolikoli on myös fusogeeninen aine. Kun sitä rikastuu lysosomeihin, Golgin laitteeseen ja plasmamebraaneihin, se vaikuttaa tehokasta kalvokuljetusta eri organellien välillä. Se on merkitsevä jatkuvassa kalvon nuppuilussa ( budding) ja fuusioissa. Sen funktio on siis elämälle välttämätöntä, niin ihmisen kuin esim. solua hyödyntävän viruksen näkökulmasta.

Dolikolirakenne on lajispesifinen, mutta ei elinspesifinen. Ihmisen dominoiva dolikoli sisältää 19-20 isopreeniosaa.
Molekyylissä on alfa-terminaali ja omega-terminaali
Animaalisessa kudoksessa vain muutama prosentti dolikolimolekyylistä on alfa-päästään cis-muodossa tyydyttämättömänä.
Paitsi hepatosellulaarisessa karsinoomassa todetaan 30 % molekyyleistä alfa cis-muodossa.
Sanotaan että dolikolia syntyy nopeasti, mutta sen hajoamistuotteita ei ole identifioitu. On ajateltu sen ehkä olevan tuntemattoman hormonin tai muun aineenvaihdunnallisesti aktiivin molekyylin prekursori.Tästä täytyy ottaa selvää.


Mevalonaattitiestä tulee myös ubikinonien sivuketju (UQ) solujen mitokondrioihin, joissa UQ on hengitystoiminnan obligatorinen komponentti. Redusoidulla ubikinonilla, ubikinolilla, on vahva scavenger-kyky ( 1 radikaali 1 molekyyliä kohden). Vain redusoitu muoto toimii antioksidanttina. Kudoksissa on normaalisti ubikinonia 10 kertaa enemmän kuin alfa-tokoferolia ( E-vitamiinia). C-vitamiini vesifaasissa tekee samaa antioksidanttifunktiota kuin ubikinoni lipidifaasissa. Suurin osa ubikinonista kehossa on aktiivissa muodossaan, paitsi aivoissa on vain 25 % ubikinonista redusoitua ( aktiivia) ubikinolia.

Mikä on dolikolin relevantti osuus 1 grammassa aivokudosta tai maksakudosta? Nämä ovat viittellisiä tietoja muistiinpanoissani n 10 v takaa.
Proteiinia 79 mg / grammassa aivoa, 181 mg/ g maksaa.
Fosfolipidejä 32 mg/g aivoa, 23 mg/ g maksaa.
Kolesterolia 13 mg/ g aivoa ja 2 mg/ g maksaa.
Dolikolia 153 ug/ g aivoa ja 578 ug/ g maksaa.
Dolikyylifosfaattia 22 ug/g aivoa ja 16 ug / g maksaa.
Ubikinonia 21 ug/ g aivoa ja 46 ug/ g maksaa.



Kaikki kolme mevalonaattitien tuotemolekyyliä ovat tärkeät neuronaalisessa funktiossa.
kolesteroli, dolikoli ja dolikolifosfaatti

SAPPIHAPOT

SAPPIHAPOT
http://themedicalbiochemistrypage.org/images/bileacidsynthesis.jpg

SAPPIHAPPOJEN SYNTEESI JA TOIMINTA

Kolesteroli on monitoimimolekyyli ja yksi sen tärkeä tehtävä on antaa runkoa sappihappojen ja sappisuolojen muodostumiseen. Sappihapot ovat eräs kolesterolin synteesitien loppuhaara ja myös tapa, millä kolesterolia erittyy poispäin kehosta. Mutta sappihappojen muodostaminen on vajaa kykyinen eliminaatiotie siinä mielessä, että ne eivät voi toimittaa kaikkea aivan liikaa kolesterolia kehosta pois. Ne ovat eräs tärkeä funktiosykli sinänsä, jonka harteille ei voi sälyttää aivan liiallisten kolesterolimäärien poistamista sivutyönä niiden kaikkien muiden funktioiden ohessa. Tähän myös ravintosuositukset ovat antaneet normejaan helpottaakseen ja pitääkseen normaalirajoissa tätä sappihapposykliä. Keho tuottaa itse 700 g kolesterolia päiväsä ja ravinnosta siihen suositeltaisiin lisää vain 300 mg päivässä (NNR 2004).

Harperin tieto jo 1969 oli tämä:
MAKSAN toimittamassa sappinesteessä on sappihappoja 1,93% ( sappirakossa niitä on 9,14%). Sapen muita komponentteja maksassa (sappirakossa) ovat vesi 97 %( 85.92 %), kiinteitä aineita 2,52% ( 14,08 %), musiineja ja pigmenttejä 0.53%( 2.98 %), rasvahappoja ja rasvoja 0.14 % ( 0.32 %), kolesterolia 0.06% ( 0.26%), inorgaanisia suoloja ( 0.84% ( 0.65 %). Maksan toimittaman sapen pH on 7.1- 7.3 (ja sappirakossa pH on 6.9- 7.7) . Nämä luvut antavat hahmotusta sapen kosotumukselle ja ovat peräisin Harperista 1969.

MAKSASSA kolesterolista alkaa tulla sappihappoja:
Reaktio, joka hydroksyloi 7alfa- aseman kolesterolimolekyylissä, on tahtia rajoittava entsyymi sappihappojen synteesissä kolesterolista käsin. 7alfa-OH- kolesterolin muuttaminen sappihapoiksi on moniaskeleinen reastio.
Konjugoituminen glyko tai tauro (kolaateiksi) johdannaisiksi tapahtuu maksan mikrosomeissa ja siinä sappihapon -COOH- ryhmään konjugoituu joko aminohappo glysiini tai aminosulfonihappo tauriini ja silloin molekyyli muuttuu vesiliukoiseen muotoon. Nämä taas ottavat kaliumi(K+) tai natrium (Na+) jonin, jolloin on kyse sappisuoloista.
Täytyy myös huomioida, että koolihappo vaatii entsymaattisen aktivoitumisen (ATP ja CoA-SH avulla) Cholyl-SCoA muotoon ennen kuin se entsymaattisesti konjugoituu tauro tai glykokolaatiksi.

SAPPISUOLAT emulgoivat ruokasulassa ja alentavat pintajännitystä, jolloin ruokamolekyylit, jotka on rasvan peittämiä tulevat paremmin entsyymeille altiiksi ja pääsevät pilkkoutumaan ja imeytymään.

PRIMÄÄRIT SAPPIHAPOT
Nämä kaksi alla mainittua sappihappoa ovat primäärejä sappihappoja, joita muodostuu kolesterolista käsin.
KOOLIHAPPO ( Cholic acid, CA) on täysin tyydytetty sterolimolekyyli, jossa on 3,7, ja 12- asemissa OH-ryhmät.
KENODEOXYKOOLIHAPPO (chenodeoxycholic acid, CDCA ) omaa OH ryhmät 3 ja 7 asemissa.
Ihmisen sapessa nämä ovat kaikkein runsaimmat sappihapot, ensinmainittua 31 % ja toiseksi mainittua 45 %.

Suolen sisällä primäärit sappihapot joutuvat bakteerivaikutukselle alttiiksi ja muuttuvat sekundäärisiksi sappihapoiksi. Kolaatista tulee deoksykolaatti ja kenodeoksykolaatista tulee litokolaatti.
SEKUNDÄÄRISET SAPPIHAPOT OVAT
DEOXYKOOLIHAPPO ( deoxycholic acid, DCA) omaa OH ryhmät 3 ja 12 –asemissa.
LITOKOOLIHAPPO ( lithocholic acid, LCA) omaa vain yhden OH-ryhmän ja se on 3-asemassa.

Enterohepaattisessa kierrossa talletetaan näitä sappihappoja. (Kuitenkin siitä kolesterolista, mitä keho päivittäin eliminoi, puolet pääsee erittymän ulostuksien kautta).

Takaisin imeytyneet sappihapot konjugoidaan uudelleen
Maksan mikrosomin sisällä talletettujen sappihappojen uudelleen konjugoituminen tapahtuu taas COOH ryhmään glysiinin tai tauriinin amidi-sillalla, ennen kuin ne taas eritetään maksan sappitiehyeisiin. Niitä sanotaan glykokonjugaateiksi ja taurokonjugaateiksi. Biliaaritiehyeistä kerätään sappea suurempiin tiehyeisiin ja välivaiheena on sappirakko, johon sappea varastoituu tulevaista tarvetta ( rasva-ateriaa) varten. Sappihappojen lopullinen päämäärä on erittyminen ohutsuolen sisään, missä ne auttavat ravintolipidien emulgoinnissa. Suolen sisällä glysiinin ja tauriinin tähteet taas irtoavat sappihapoista ja nyt siten ne voivat joko erittyä ( pieneltä prosentilta) suolen muun massan joukossa tai ne absorboidaan uudestaan suolesta takaisin ja kuljetetaan maksaan. Tämä sykli on se enterohepaattinen kierto ( maksa- sappi- suoli- takaisin imeytyminen-maksasoluun oto jne) (enterohepatic circulation).

ULOSTUKSEEN erittyy normaalisti eniten näistä sappihapoista deoxykoolihappomuotoa. Mutta kolesteroliperäisiä muitakin eritemuotoja havaitaan, kuten neutraaleja steroideja ja fekaaleja steroleja, kuten coprostanolia, joka muodostuu alemmissa osissa suolistoa suoraan kolesterolista bakteerivaikutuksesta, joten kolesterolin poistaminen kehosta ei ole ainoastaan sappihappojen erittämisen varassa.

MITEN SAPPIHAPPOJEN HOMEOSTAASI SÄÄTYY

Sappihapot ja niistä erityisesti kenodeoxykoolihappo(CDCA) ja koolihappo(CA) voivat säätää geeniexpressiota, joka osallistuu niiden synteesiin ja täten ne voivat luoda takaisinsyöttömekanismin (feed back). Tämän säätelytien löytyminen tapahtui samalla kun selviteltiin farnesoidi-X-reseptoreja (FXRs) . FXRs-ovat eräs tumareseptorien superperhe joihin kuuluu steroidi/thyroidihormonireseptorien perhe ja myös maksan X-reseptorit (LXRs), retinoidi-X-reseptorit (RXRs) ja peroksisomiproliferaattori-aktivoituvat reseptorit (PPARs).

On olemassa kaksi geeniä, jotka koodaavat FXRs reseptoreita ja ne on merkattu FXRalfa ja FXRbeeta-nimillä.Ihmisellä on ainakin neljä isoformia alfa-reseptorigeenistä tuloksena aktivoitumisesta eri promoottoreilla ja alternantiivisista pilkkoutumisista ( FXRalfa 1,2,3, ja 4) . FXR-geeni tunnetaan myös nimellä NR1H4-geeni( tumareseptori NR alaperhe 1, ryhmä H, jäsen 4) . FXR-geenejä exspressoituu korkeimmin pitoisuuksin suolistossa ja maksassa.

Kuten kaikki tämän superperheen reseptorit, ligandi sitoutuu reseptoriin sytoplasmassa ja sitten kompleksi migroituu tumaan (nucleus) ja muodostaa heterodimeerin perheen muiden jäsenten kanssa. FXR muodostaa heterodimeerejä RXR-perheen jäsenten kanssa . Heterodimeerin muodostumista seuraa kompleksin sitoutuminen kohdegeenin spesifiseen sekvensiin, jota sanotaan hormoniin vastaavaksi elementiksi (HREs) ja tästä seuraa säädelty expressio. Yksi FXR:n pääkohteista on pieni heterodimeerinen partnerigeeni (small heterodimer partner (SHP) gene.Kun FXR on aktivoinut SHP-expression seuraa SHP-kohdegeenien transskription estymä.
Merkityksestä sappihappojen synteesille mainittakoon, että SHP vaimentaa kolesteroli 7-hydroxylaasigeenin ilmenemistä (CYP7A1). Ja juuri CYP7A1 taas on tahtia rajoittava entsyymi sappihappojen synteesissä kolesterolista käsin.

Eräs yrttiperäinen kolesterolia alentava supplementti jota sanotaan ”gugguliksi”. vaikuttaa siten, että tämän uutteen lipidikomponentti guggulsteroni (guggul = Commiphora mukul-puu Intiasta) toimii antagonistina FXR:lle. Mutta sen lisäksi että guggulsteroni vaikuttaa FXR-funktioon , se on näyttänyt voivan aktivoida pregnaani-X-reseptorinkin(PXR), joka on toinen tumareseptorien superperhe. PXR on todettu olevan litokoolihapon (LCA) ja muiden sappihappoprekursorimuotojen tunnistama reseptori. PXR-aktivaatio johtaa sappihapposynteesin vaimentumiseen, koska sillä on fysikaalista liittymää hepatosyytin tumafaktoriin 4alfa (HNF-4alfa), mikä vaikuttaa että tämä transkriptiotekijä ei enää kykene assosioitumaan transkriptionaaliseen co-aktivaattoriin PGC-1alfa (PPARgamma coaktivaattori 1 alfa), mikä taas lopulta johtaa CYP7A1 transkriptiofaktorin aktivaation katoamiseen . Sappihappometabolian säätelyn lisäksi PXR alentaa glukoneogeneesientsyymin PEPCK ilmenemää.

Muidenkin sappihappojen synteesiin puuttuvien geenien ilmenemistä säädellään FXR-toiminnalla. FXR- aktio voi joko indusoida tai vaimentaa näiden geenien expressoitumista.

Vaimentuvia geenejä on
edellä mainittu CYP7A1
ja lisäksi SREBP-1c,
steroli 12alfahydroksylaasi( jonka geenisymboli on CYP8B1
ja SLC10A1 (= solute carrier family 10 (sodium/bile acid cotransporter family), member 1 (gene symbol = SLC10A1).

Tämä viime mainittu geeni tunnistetaan Natrium (Na+)taurokolaatti-yhteiskuljettajapolypeptidinä NTCP (= Na+-taurocholate cotransporting polypeptide ).
NTCP on mukana siinä tapahtumassa, kun sappihappoja otetaan maksaan sinusoidaalin/basolateraalin kalvon kautta.
Täten sappihappojen välittämä NTCP-geeniexpression vaimenema voisi vähentää sappihappojen talteenottoa ja suojata maksaa liiallisten sappihappomäärien kertymän toksisilta vaikutuksilta.

Sappihapot vaimentavat myös erään toisen sappihappokuljettajan transskriptiota- tätä esiintyy sinusoidaalisessa/basolateraalisessa kalvossa. Tämä kuljettaja on natriumista riippumaton ja sitä nimitetään nimellä OATP1B1 (organic anion transporting polypeptide). Sen geenisymboli on SLCO1B1.
OATP1B1 merkattiin aiemmin OATP-C. Sappihappojen vaikutus OATP1B1 expressioon on epäsuora ja käsittää SHP-välitteisen aleneman HNF-4alfa-aktiviteetissa, mikä puolestaan vähentää toista maksaan rikastunutta transkriptiotekijää HNF-1alfa, ja se on taas tämän OAT1B1-geenin pääaktivaattori.

FXR:n indusoimiin geeneihin
SHP:n lisäksi kuuluu
maksan sappisuolojen ulospumppaaja (BSEP, bile salt export pump), monilääkeresistenssiproteiini3 ( multidrug resistance protein 3 MDR3)
ja monilääkerestenssiin littyvä proteiini2 ( multidrug resistance associated protein 2(MRP2).

Jälkimmäiset geenit ovat osallistuneet orgaanisten yhdisteiden uloskuljetukseen ja ne pystyttiin tunnistamaan niiden kyvystä kuljettaa lääkkeitä pois solusta, jolloin ne sallivat solulle kykyä vastustaa annetun lääkkeen tarkoittamaa vaikutusta.

MDR3 toimii normaalisti siten, että se translokoi fosfolipidejä hepatosyytin canalikulaarisen kalvon kautta. MDR3 on jäsen ATP:.tä sitovien kuljetusmolekyylien perheessä (ATP-binding cassette (ABC) family). MDR3 tunnetaan ABCB4.
Tästä voi päätella, että sappihappojen välittämä MDR3 expression lisääntymä on välttämätöntä, jotta maksasoluille salliutuu mahdollisuus vastata sappihappojen toksisuuteen muodostamalla kolesterolia, fosfolipidejä ja sappihappoja sisältäviä misellejä.

BSEP on myös jäsen ABC-kuljettajamolekyylein perheessä ja silläkin on toinen nimi: ABCB11. Se osallistuu sappihappojen uloskuljettamiseen maksasoluista ja täten se vähentää sappihappojen toksisuutta näissä soluissa.

Pääasiallisin kliininen merkitys näillä FXR kohdegeeneillä tulee kyseeseen useissa perinnöllisissä kolestaattisissa maksahäiriöissä. BSEP-mutaatiot ja MDR3 mutaatiot ovat assosioituneet familiaaliseen intrahepaattiseen kolestaasiin tyyppiä 2 ja vastaavasti tyyppiä 3
Mutaatio MRP2 geenissä liittyy Dubin-Johnsonin oireyhtymään, mikä on eräs muoto perinnöllistä hyperbilirubinemiaa.

SAPPIHAPOT AINEENVAIHDUNNALLISINA SÄÄTELIJÖINÄ

Sappihapoille on alunperin tunnistettu neljä primääriä fysiologisesti merkitsevää funktiota.
1.Sappihappojen synteesi ja sitä seuraava erittyminen fekekseen edustaa ainoaa merkitsevää liian kolesterolin eliminaatiomekanismia.
2. Sappihapot ja fosfolipidit saattavat sapessa olevan kolesterolin liukenemaan ja siten estävät että ei muodostu kolesterolikiviä ja saostumaa sappirakossa.
3. Sappihapot edistävät ravintorasvan, triasyyliglyceridien (TG) sulamista emulgoimalla, jolloin rasvat ovat paremmin haimalipaasien pilkottavissa.
4. Sappihapot edistävät rasvaliukoisten vitamiinien A,D, E ja K imeytymistä suolistosta.

Viime aikoina on saatu uusia oivalluksia sappihappojen biologisista vaikutuksista.
Sappihapot kontrolloivat omaa aineenvaihduntaansa ja kuljetustaan enterohepaattisessa kiertokulussa ,
säätelevät lipidien aineenvaihduntaa,
säätelevät glukoosin aineenvaihduntaa,
kontrolloivat maksan regeneroitumisen signalointitapahtumia
ja säätelevät yleistä energian käyttöä.

Sen jälkeen kun on saatu eristettyä, hahmotettua ja luonnehdittua FXR ( farnesoidireseptorit), joiden fysiologisia ligandeja sappihapot ovat, on alkanut selvitä sappihappojen funktiot lipidien ja glukoosin homeostaasin säätelyssä.

Kuten yllä on viitattu, sappihappojen sitoutuminen FXR-reseptoreihin johtaa useiden sappihappohomeostaasiin osallistuvien geenien expression vaimentumiseen.
Kuitenkaan sappihappojen aineenvaihduntaan osallistuvat geenit eivät ole ainoita, jotka ovat sappihappojen sitoutumisen seurauksena johtuvasta FXR-aktiosta säätyviä.

Maksassa FXR-aktion tiedetään säätävän
lipidimetaboliaan osallistuvien geenien ilmenemistä ( esim SREB-1c)
lipoprotiinimetaboliaan osallistuvien geenien ilmenemistä ( esim apoC-II)
glukoosimetaboliaan osallistuvien geenien ilmenemistä ( kuten PEPCK)
ja hepatoprotektioon osallistuvien geenien ilmenemistä( kuten ( CYP3A4), mikä aluksi tunnistetiin nifedipiinioksidaasina ja nifedipiini taas oli kalsiumkanavaa blokeeraava lääkeryhmän aine.

Sen lisäksi että sappihapot osallistuvat rasvojen emulgoimiseen suolessa ja aktivoivat FXR-reseptoria, ne osallistuvat myös useisiin signaalitransduktioprosesseihin aktivoimalla c-JUN-N terminaalisen kinaasin (JNK) ja myös mitogeenilla aktivoituvan proteiinikinaasin (MAPK) tiet.

Toisia jäseniä tumareseptoriperheestä, joita sappihapot pystyvät aktivoimaan, on
edellä mainittu pregnaani-X-reseptori(PXR),
sekä konstitutiivinen androstaanireseptori (constitutive androstane receptor, CAR)
ja vitamiini D-reseptori (VDR).
Sitten on vielä eräs lisäreseptori, joka aktivoituu vasteena sappihapoille ja sillä voi olla merkitystä obesiteetin kontrollissa. Tämä on transmembraaniseen G-proteiinin kytkeytynyt sappihapporeseptori-1 , alunperin sen merkintä oli TGR5. Kun TGR5 aktivoituu ruskeassa rasvakudoksessa, seuraa termogeniinin aktivaatio, mikä johtaa lisääntyneeseen energien kulutukseen (thermogenin (uncoupling protein 1, UCP1).