Isoprenylaation tärkeys. GAP vaje ja RAS hyperaktivaatio, KRAS onkogeeni

Nyhet: 2011-05-11

Anna‐Karin Sjögren är årets mottagare av Assar Gabrielssons Pris. Hon får priset för sin avhandling som ger ökad kunskap om hur olika cancerformer utvecklas och upptäckt av möjliga måltavlor för cancerbehandling.
Assar Gabrielssons fond delar varje år ut priset för utmärkt avhandling i cancerforskning . Titeln på Anna-Karin Sjögrens avhandling är: “The Importance of Isoprenylation and Nf1 Deficiency in K‐RAS‐induced Cancer”. Fondens motivering till priset är: ”Avhandlingen håller hög vetenskaplig kvalitet i ett internationellt perspektiv med betydande relevans för framtida cancerbehandling”.


Perjantai 20. marraskuuta 2009 silmäilin uutta väitöskirjaa:

Löysin kirjastosta 2009  uuden väitöskirjan isoprenylaation tärkeydestä.
Siinä kerrottiin myös onkogenin K-RAS indusoimasta syövästä ja GAPs( inhibiittorin) Nft-vajeesta.

LÄHDE:
Sjögren Anna-Karin. The importance of isoprenylation and  Nf1 Deficiency in K-Ras-induced Cancer.
ISBN 978-91-628-7915-0 Göteborg 2009.

ABSTRAKTIN suomennosta:
RAS ja RHO proteiiniperheet ottavat osaa tuumorien muodostumisiin ja metastasoitumisiin ja ne kuuluvat ns. CAAX-proteiineihin. Näiden CAAX-proteiinien kohdistuminen solukalvoon ja niiden kunnollinen funktio riippuu posttranslatorisesta isoprenylaatiosta FTaasi- tai GGTaasi-1 entsyymeillä

FTaasi= farnesyylitransferaasi.
GGTaasi -1 = geranyl-geranyyli-transferaasi-1.

On kehitetty FTaasi-estäjiä (FTI) , inhibiittoreita (ja GGTRaasi-1 inhibiittoreita tarkoituksella blokeerata RAS-tekijöitten indusoiman syövän muodostus, mutta niiden hyödyllisyys on vaikea arvioida, koska kohdevaikutukset puuttuvat: lääkeresistenssi ja toksisuus.
Tämän työn yksi tarkoitus oli käyttää geneettisiä strategioita koe-eläimessä ja määrittää CAAX-proteiinin isoprenylaation fysiologinen tärkeys ja arvioida FTaasi ja GGTaasi-1 entsyymit mahdollisina anti-syöpälääkkeen kohteena.

Onkogeeninen mutaatio RAS:issa on tavallista syövässä ja johtaa RAS-signaloinnin hyperaktiivisuuteen.
Kuitenkaan RAS-mutaatio yksinään ei riitä ihmisen syövän kehittymiseen. Pikemminkin syöpä saa alkunsa useitten mutaatiotapahtumien keskeisten ko-operaatioitten seuraamuksena.

Eräs RAS-inaktivaattoriproteiini on NF1, tuumorisuppressorigeeni neurofibromatoosi tyyppi 1. Niinpä NF1 puute myös johtaa hyperaktiiviseen RAS-signalointiin, mitä muutamissa syöpätyypeissä esiintyy.

Mutta NF1 voi olla muissakin teissä operoimassa. Ei olla selvillä siitä, jos NF1 vaje on epäolennainen , tarpeeton, RAS-indusoidussa syövän kehittymisessä tai jos kaksi mutaatiota ko-operoi. Väitöstyön toinen tarkoitus oli määrittää NF1-vajeen merkitys K-RAS-indusoidun syövän kehittymisessä hiirillä.

Työssä käytettiin geenikohdennustekniikkaa hiirissä, jolloin samanaikaisesti aktivoitiin onkogeeninen K-RAS alleeli, jolloin indusoitui keuhkosyöpää tai myeloista leukemiaa,
ja inaktivoitiin entsyymejä FTaasia ja GGTaasia-1 koodaavat geenit.

Kun inaktivoitiin se geeni, joka koodasi entsyymin GGTaasi-1 beeta-alayksikköä, eliminoitui entsyymiaktiivisuus, proliferoituminen blokeerautui ja motiliteetti väheni fibroblasteista.
Edelleen tämän entsyymin GGTaasi-1 inaktivaatio vähensi tuumorin muodostumista ja lisäsi hiirten elossapysymistä K-RAS-indusoimassa keuhkosyövässä.
Lopuksi havaittiin, että useat solutyypit, myös keuhkon tuumorisolut ja makrofagit jäivät elinkykyisiksi GGTaasi-1 entsyymin puutteessa.

Sitten kun inaktivoitiin FTaasi entsyymin beeta-alayksikköä koodaava geeni, eliminoitui farnesylaatio HDJ2 ja H-RAS proteiineista, H-RAS-proteiinin  kohdistuminen plasmakalvoon estyi ja fibroblastien proliferoituminen blokeerautui.
FTaasin inaktivaatio vähensi tuumorin muodostumista ja lisäsi hiirien elossapysymistä K-RAS-indusoiduissa syövissä samaan määrään asti kuin GGTaasi-1 inaktivoitumisessakin.

Kun samanaikaisesti inaktivoitiin sekä FTaasi että GGTaasi-1, väheni keuhkotuumorit huomattavasti ja elossapysyminen parani.

Näistä tiedoista voidaan päätellä, että FTaasin ja GGTaasi-1:n estäminen voisi olla hyödyllistä K-RAS indusoitujen syöpien hoidossa.

Hiirissä seuraa myeloproliferatiivisia häiriöitä (MPD), jos ilmenee onkogeenistä  K-RAS proteiinia  tai jos  Nf1 inaktivoituu hematopoieettisissa soluissa. Nämä MPD:t eivät progredioidu akuutiksi myeloiseksi leukemiaksi (AML). Mutta jos samaan aikaan inaktivoituu Nf1 ja aktivoituu onkogeeninen K-RAS hematopoieettisissa soluissa, indusoituu hiirissä AML, akuutti myeloinen leukemia. AML-hiirissä ei ollut aktiivin RAS-proteiinin  pitoisuudet lisääntyneet, joten tästä heräsi ajatus mahdollisesta Nf1-puutteesta, joka voisi osaltaan vaikuttaa akuuttia myeloista leukemiaa non-RAS- teitse.

Tämä tulos viittaa vahvaan ko-operaatioon Nf1-puutteen ja onkogeenin K-RAS kesken ja tuo uutta valoa RAS-indusoidun leukemian kehittymisen mekanismiin.

....

VÄITÖSKIRJAN TAUSTATEKSTISSÄ kuvattiin normaalia isoprenylaatiota, sen entsyymejä ja aineenvaihdunnallisia ratoja.

• ISOPRENOIDIEN SYNTEESITIE (kertausta)

Tämä tie kuuluu osana kolesterolin synteesikarttaan, missä lähtöaine on aktivoitu etikkahappo (AcetylCoA), josta ensin tulee mevalonaattia. Tässä vaiheessa estäjälääke on statiini nimeltään.

Mutta mevalonaatista eteenpäin vaikuttaa farnesyyli difosfaatti syntaasi (FPP-syntaasi), joka samalla dekarboksyloi, kun muodostuu isopentenyyli-PP (IPP)(5C)
Samalla entsyymillä edelleen muodostuu geranyyli-PP (10C).
Molekyyli kasvaa edelleen farnesyyli-PP:ksi (15C) , FPP.

Tästä eteenpäin voi muodostua skvaleenisyntetaasilla skvaleenia, jossa on 30C tai geranyyligeranyylidifosfataasisyntetaasilla muostostuu  GG-PP (20C).

Skvaleenitie jatkaa kohti kolesterolin muodostamista.
Kolesterolia on kaikissa solukalvoissa rakenneosana ja sen on tärkeä normaaliainen.

Mutta keho käyttää FPP ja GG-PP molekyylejä tekemään eräisiin proteiineihin isoprenylaatioita, posttranslationaalista rakenteellista modifikaatiota.
Isoprenylaatiolla proteiinit saavat itselleen kuljetuksen solukalvoon tai solunsisäisiin rakennelmiin, siis tarkan osoitteen ja hyvän sijainnin, jolloin ne ovat  erilasiten  signaalien ja vaikutusten ulottuvilla.  

• ISOPRENYLAATIOTA VAATIVAT PROTEIINIT

Eräät ns. CAAX-proteiinit vaativat tällaisen posttranslationaalisen käsittelyn, jossa tapahtuu isoprenylaatio C (cysteiini) molekyyliin, sitten endoproteolyysi, jossa aminohapot -AAX pilkotaan irti, ja sitten taaphtuu  metylaatio, jossa CH3- metyyli liitetään cysteiiniin.

Osa CAAX-proteiineista ottaa isoprenyylirakenteeksi farnesyylin ja osa ottaa geranylgeranyylin riippuen X aminohaposta.
Farnesyyliliitos tapahtuu, jos X = seriini, metioniini tai glutamaatti.
Geranylgeranyyliliitos tapahtuu , jos X = leusiini tai fenylalaniini.

Nämä kolme posttranslationaalista modifikaatiota muuttavat molekyylin hydrofobiseksi ja niin se saa "osoitelapun", kuljetuksen subsellulaarisiin kohteisiinsa.
Isoprenylaatioota tekevät   FT  (FTaasi) ja  GGTaasi-1- entsyymit.
Endoproteolyysin tekee RCE1, (RAS converting enzyme, RAS. proteiinia muuntava entsyymi) .
Metylaation tekee ICMT, isoprenyl-cysteine –carboxyl-methyltransferase.

Siis isoprenylaatiossa kovalentti F ( farnesyl) tai GG ( geranylgeranyl) isopreenilipidi liittyy CAAX proteiinin cysteiinitähteeseen (C_)

FNTA on se geeni, joka koodaa FTaasi-entsyymin ja GGTaasi-1 entsyymin alfa-alayksikköä.
FNTB koodaa FTaasi-entsyymin beeta –alayksikköä .
PGGT1B on geeni, joka koodaa GGTaasi-1 entsyymin beeta-alayksikköä.
FNTB ja PGGT1B ovat  vain 25%:lta identtisiä keskenään.
Beeta-alayksikkö määrää substraattispesifisyyden.
FTaasi ja GGTaasi ovat sinkkimetalloentsyymeitä (Zn++). FTaasi tarvitsee lisäksi  ( magnesiumia Mg++)jotta katalyyttinen tehtävä onnistuu täydellä aktiivisuudella.

• CAAX on proteiinin tunnistusmotiivi:

FTaasi tunnistaa siinä X aminohappoja alaniini(A) , glutamiini(Q), seriini (S), metioniini  (M) tai fenylalaniini (F).
GGTaasi tunnistaa useimmiten leusiinia (L), myös fenylalaniinia (F) ja joskus metioniinia (M).

FTaasin selektiiviset proteiinisubstraatit ovat: RAS, tuman laminiini, transduciiningamma-alayksikkö, rhodopsiinikinaasi, centromeeriproteiinit.

GGTaasin selektiiviset substraatit ovat: RHOA, RHOC, RAC, RAP, heterotrimeeri G-proteiini gamma alayksikkö.

• On olemassa kolme RAS-onkogeeniä. H-RAS, , N-RAS ja K-RAS.

H-RAS varsinkin vaatii farnesylaation. Jos on farnesylaation inhibitio (FTI), tapahtuu solusyklin jarruttumsita. Tällä on tehoa joissain tuumoreissa. Mutatoitunut RAS-aktivaatio osaltaan vaikuttaa tuumoreita, progredioimista ja metastaaseja.

• NORMAALISOLUSSA ON HYVIN TIUKKA RAS-SIGNALOINTI.

RAS toimii molekulaarisena vaihteena, joka muuttaa solun ulkoisen ( extrasellulaarisen) signaalin solun vasteeksi. Signaali voi olla esim kasvutekijä, ja vaste on tällöin solun kasvua. Signaali voi olla myös sytokiinejä. Soluvasteet ovat proliferaatiota, differentiaatiota ja solun elossapsymistä.
Kun signaali on otettu vastaan, adaptoriteitse ( GRB2, SHC), rekrytoituu GEFs, jotka stimuloivat nukleotidimuutoksen RAS-proteiinissa, joka aktivoituu ja GTP-RAS-määrä lisääntyy.
Mutta on myös inhibiittoreita GAP ( ainakin kuusi erilaista), jotka heti inaktivoivat RAS-proteiinia stimuluksen päästyä siihen. Eräitä GAP proteiineja on p120GAP ja NF1.

• RAS-GTP on interaktiossa useisiin effektoriproteiiniperheisiin.

(1) Näistä ensiksi opittiin tuntemaan RAS-RAF-MEK-ERK-signalointitie. Aktiivi ERK stimuloi transkriptiotekijöitä, jotka voivat aktivoida solusykliä säätävien proteiinien ( kuten sykliiniD) ilmenemisen. Siitä aiheutuu solusyklin progressio.

(2) RAS-PI3K-PDK1-AKT . Tämä enstyymi PI3K johtaa sekundäärivälittäjäaineen PIP3 muodostumiseen ja se taas aktivoi kinaasin PDK1 ja AKT. AKT taas edistää solun elossapysymistä fosforyloimalla ja siten inaktivoimalla useita proaptoottisia proteiineja ( kuten BAD).

(3) RAS-PI3K-RAC (RHO-perheen GTP-aasi). Tästä tiestä säätyy aktiinisytoskeleton ja NF-kB välitteinen transkriptio.

(4) RAS-TIAM1-RAC

(5) RAS- RAL-GEF (RAL-GDS). Tämä on eräs toinen RAS-perhe, joka stimuloi RAL, joka aktivoi PLD entsyymin. Arvellaan, että RAL-GDS tie osallistuu Forkhead-transkriptiotekijöitten estämiseen, jolloin edistyy solusyklin progressio ja solun elossapysyminen. Rakkuloitten kuljetus vaikuttuu.

(6) RAS-PLC. PLC aktivaatio johtaa entsyymin PKC ( proteiinikinaasi C) aktivaatioon. Tässä on myös kalsiumsignalointia.

RAS-signalointijärjestelmässä on ainakin kaksi mutaatiokohtaa.
 Toinen koskee RAS-aktivaatiota ja toinen GAP-inhibitiota.
Mutaatiot niissä johtavat RAS hyperaktivaatioon.

• Inhibiittorikehittely

On kehitelty FTI ja GGTI lääkeaineita, farnesyylitransferaasin inhibiittoreita geranylgeranyltransferaasin inhibiittoreita etsittäessä syövänvastaisia lääkeaineita. Tästä asiasta on paljon tekstiä tässä väitöskirjassa.

Statiinin osuus isoprenylaatioissa on molempien , farnesylaation ja geranylgeranylaation epäspesifistä estämistä varhaisvaiheessa tarkoituksella vähentää kolesterolin muodostumista, mutta on havaittu muitakin vaikutuksia.

IPP-lipidien synteesin määrän aleneminen
(1) vähentää kolesterolin synteesiä
(2) vähentää GGPP synteesiä ja kalvoon kohdistumista
ja (3) aiheuttaa apoptoosia tuumorisoluissa.
..